髓芯減壓聯(lián)合生骨再造丸對(duì)兔激素性股骨頭壞死骨組織BMP-2與VEGF mRNA的影響*

魏玉嬌，何 玲，郭小榮，曹林忠 ，張虎林 ，張曉剛，郭成龍△

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

激素性股骨頭壞死是使用激素最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，發(fā)病率高、致殘率高，臨床治療手段有限，給患者心理、經(jīng)濟(jì)帶來(lái)壓力［1］。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，髓芯減壓聯(lián)合生骨再造丸對(duì)早期激素性股骨頭壞死療效明顯［2］。本研究通過(guò)觀察骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討生骨再造丸對(duì)激素性股骨頭壞死的防治機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康成年雄性青紫藍(lán)兔60只，體質(zhì)量（2.0±0.20）kg，清潔等級(jí)二級(jí)，由甘肅省生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-0001，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物 生骨再造丸由黃芪、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、血竭、三七等藥物組成（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院純中藥制劑，批號(hào)：151207）；大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS，美國(guó)Sigma公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20040139，批號(hào)：LL0411，規(guī)格：25 mg/ 瓶）；甲強(qiáng)龍（美國(guó)輝瑞生物制藥公司，批號(hào)：F4088306）；青霉素（80萬(wàn)U，哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號(hào)：F40088305）。

1.3 試劑 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、多聚甲醛、戊巴比妥鈉、乙二胺四乙酸二鈉由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨研所提供，均購(gòu)自天津華生試劑有限公司。

1.4 儀器 ZT-12J1型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所）；OLYMPUS VANOX型自動(dòng)光學(xué)顯微鏡（JAPAN）；OLYMPUS型生化儀（日本，LC-005）；202-ZAB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；總RNA提取試劑盒Ⅱ（美國(guó) OMEGA 公司，批號(hào)：R6934）；TIANScript cDNA型第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司，批號(hào)：RT120420）；PCR 引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司）；2×Taq PCR Master Mix 型（天根生化科技有限公司，批號(hào)：KT201-02）；50bp DNA Ladder Marker（北京博凌科為生物科技有限公司，批號(hào)：M07-01）。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物分組 60只青紫蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即N組：正常對(duì)照組（8只）；Y組：模型對(duì)照組，M組：生骨再造丸組，S組：手術(shù)組，SM組：綜合治療組，每組13只。

1.5.2 動(dòng)物造模 兔子耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS，Sigma 公司產(chǎn)品）50 μg/kg 共 2 次，每次間隔24小時(shí)，最后1次注射LPS后臀肌注射甲基強(qiáng)的松龍（MP，20 mg/kg）共3次，每次間隔24小時(shí)。4周后模型成立。

1.5.3 給藥及飼養(yǎng) 模型成立后第2天開始灌胃，灌胃劑量按照人與家兔體表面積折算的等效劑量比例換算，生骨再造丸配制成每毫升所含生藥相當(dāng)于3 g原藥材的濃縮液，M組、SM組給藥劑量4.6 mL/（kg·d），連續(xù)灌胃 8周。N 組和 Y 組予等量［4.6 mL/（kg·d）］生理鹽水連續(xù)灌胃 8周。單籠標(biāo)準(zhǔn)兔子顆粒飼料喂養(yǎng)（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），自由飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng)，控制室溫在（22±1）℃，光照與黑暗時(shí)間為每12小時(shí)交替。

1.5.4 手術(shù)方法 手術(shù)組采用髓芯減壓術(shù)治療。動(dòng)物俯臥于手術(shù)臺(tái)上，局部備皮后消毒，沿大轉(zhuǎn)子切開皮膚、皮下，分離肌肉及骨膜，在大轉(zhuǎn)子上用2 mm細(xì)鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆孔，以不越過(guò)股骨頭軟骨面為界。徹底清除髓腔后關(guān)閉切口，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素10萬(wàn)U以預(yù)防感染，1次/d，共1周。

1.5.5 取材與處理 第11周采用靜脈推注空氣法處死家兔，觀察大體標(biāo)本。然后完整無(wú)損地切取雙側(cè)股骨頭，將雙側(cè)股骨頭沿正中冠狀面剖開，4%多聚甲醛液固定，10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）脫鈣，系列酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。光鏡下觀察骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔脂肪細(xì)胞變化，計(jì)數(shù)空骨陷窩，計(jì)算空骨陷窩率。

1.5.6 BM P-2與V EG F m RN A表達(dá)的檢測(cè) 清除股骨頭表面組織，沿基底部將股骨頭鋸下后沿矢狀面剖開，取骨組織50 mg，按試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，用微量核酸蛋白分析儀計(jì)算所提RNA含量和純度。取總RNA 2μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA，β-actin 上游引物：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′；BMP-2 上游引物：5′-GTCCTGAGCGAGTTCGAGTT-3′，下游引物：5′-TGAAGCTCTGCTGAGGTCAT-3′；VEGF 上游引物：5′-AGGAGACAATAAACCCCACG-3′，下游引物：5′-CACACTCCAGGCTTTCATCAT-3′。

β-actin、BMP-2、VEGF 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：375bp、308bp、187bp。PCR 擴(kuò)增條件（25 μL體系）：94℃預(yù)變性2分鐘；95℃變性30 s，退火溫度30 s（β-actin 55℃、TGF-β154℃、CTGF 56℃）72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5分鐘，4℃冷卻5分鐘。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定灰度值，以β-actin mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，以BMP-2 mRNA和VEGF mRNA值與β-actin mRNA的灰度比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 N組動(dòng)物精神飲食活動(dòng)正常，無(wú)死亡。造模各組在臀肌注射甲基強(qiáng)的松龍（MP）后出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、皮毛失去光澤、體毛干枯脫落、皮下脂肪減少、大便溏薄等表現(xiàn)。至第3周時(shí)上述表現(xiàn)逐漸消失，動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)明顯變化，精神狀態(tài)及活動(dòng)良好。

2.2 股骨頭標(biāo)本觀察 各組股骨頭標(biāo)本外形大體正常，關(guān)節(jié)軟骨變薄、略蒼白色，未見明顯軟骨剝脫或股骨頭塌陷。HE染色Y組骨小梁排列散亂、稀疏、部分骨小梁萎縮、斷裂，周圍無(wú)成骨細(xì)胞，骨髓內(nèi)造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞壞死，骨髓腔擴(kuò)大。M組骨髓內(nèi)血管擴(kuò)張，骨小梁稍細(xì)，結(jié)構(gòu)基本完整，骨小梁周圍偶見少量成骨細(xì)胞，空骨陷窩較Y組減少，脂肪細(xì)胞較多，造血細(xì)胞較多，骨髓細(xì)胞分布不均勻。S組骨小梁變細(xì)，結(jié)構(gòu)基本完整，形態(tài)不規(guī)則、骨髓內(nèi)大面積造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞壞死，壞死周圍可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。SM組骨小梁粗大、結(jié)構(gòu)基本完整，骨小梁周圍可見大量成排骨母細(xì)胞，脂肪細(xì)胞少，軟骨下骨細(xì)胞飽滿、空陷窩少，可見大量造血細(xì)胞，骨髓細(xì)胞分布均勻。M組、S組、SM組骨小梁較Y組密集，脂肪細(xì)胞逐次減少，造血細(xì)胞增多，有利于骨壞死的修復(fù)，其中S組和SM組尤為明顯。與Y組比較，各治療組空陷窩率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以MS組降低最為顯著（P＜0.01），見圖1—4及表1。

圖1 模型對(duì)照組（Y組，×400）

圖2 生骨再造丸組（M組，×400）

圖3 手術(shù)組（S組，×400）

圖4 綜合治療組（SM組，×400）

表1 各組家兔股骨頭空陷窩率比較（±s） %

表1 各組家兔股骨頭空陷窩率比較（±s） %

注：與模型對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

組別 只數(shù) 空陷窩率模型對(duì)照組 12 24.34±3.52生骨再造丸組 12 17.32±2.51*手術(shù)組 12 19.68±1.75*綜合治療組 12 14.30±2.06**

2.3 各組兔股骨頭骨組織中BM P-2及V EG Fm RN A表達(dá) 與Y組比較，各治療組BMP-2和VEGF mRNA表達(dá)升高，其中M及MS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以MS組BMP-2及 VEGFmRNA水平升高最為顯著（P＜0.01），見表 2。

表2各組家兔BM P-2與V EG F m RN A表達(dá)比較（±s）

表2各組家兔BM P-2與V EG F m RN A表達(dá)比較（±s）

注：與模型對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

組別 只數(shù) BM P-2 V EG F模型對(duì)照組 12 0.22±0.02 0.36±0.04生骨再造丸組 12 0.42±0.05** 0.58±0.04*手術(shù)組 12 0.28±0.05 0.44±0.07綜合治療組 12 0.49±0.06** 0.76±0.08**

3 討論

激素性股骨頭壞死是一種應(yīng)用激素后造成的以無(wú)菌性骨壞死為特征的疾病，是無(wú)創(chuàng)性股骨頭壞死的首要原因，然而，目前針對(duì)激素性股骨頭壞死的現(xiàn)有臨床治療方案收效甚微［3］。激素性股骨頭壞死屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“骨蝕”“痹癥”“骨痹”“髖骨痹”“骨蔞”等范疇［4］。該病的發(fā)生與先天不足、后天失養(yǎng)、外傷等因素密切相關(guān)［5］。臨床對(duì)該病的認(rèn)識(shí)雖各有側(cè)重，但不外乎虛、痰、瘀3個(gè)方面，故中醫(yī)藥對(duì)該病的治療以補(bǔ)腎、健脾、活血化瘀為基本思路［6］。由于該病晚期致殘率較高，因此越發(fā)重視該病的前期保守治療。在骨生長(zhǎng)及修復(fù)期，骨的形成主要依靠骨的血管來(lái)啟動(dòng)和完成［7］。臨床大劑量應(yīng)用激素后引起血管損傷，股骨頭血供中斷，從而引起缺血壞死，故改善股骨頭血供、促進(jìn)股骨頭內(nèi)血管再生是防治激素性股骨頭壞死的關(guān)鍵［8］。研究證實(shí)［9-10］，BMP-2、VEGF 等細(xì)胞因子參與了激素性股骨頭缺血壞死的病理生理過(guò)程，該病的發(fā)生與BMP-2、VEGF表達(dá)異常密切相關(guān)。BMP-2是一類具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖與分化、促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)血液循環(huán)重建具有重要作用［11］；VEGF作為調(diào)控血管生成的重要細(xì)胞因子，其促進(jìn)微血管形成作用對(duì)股骨頭壞死的病理演變及壞死修復(fù)起重要作用，VEGF可通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨的微血管生成而參與骨形成［12］。

生骨再造丸是甘肅省名中醫(yī)張曉剛教授的經(jīng)驗(yàn)方，有補(bǔ)肝益腎、益氣活血、通陽(yáng)利濕的功效。方中淫羊藿、鹿角膠、骨碎補(bǔ)等補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；黃芪補(bǔ)益脾肺之氣，配合丹參、三七、血竭、山楂等行氣活血化瘀，促進(jìn)氣血運(yùn)行。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生骨再造散可縮短骨折愈合過(guò)程所需時(shí)間，提高骨折愈合質(zhì)量［13］，還可明顯降低家兔血漿黏度、全血黏度和紅細(xì)胞壓積，認(rèn)為生骨再造散防止激素性股骨頭壞死的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)理可能與其對(duì)血液流變學(xué)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)［14］。髓芯減壓術(shù)作為治療股骨頭缺血性壞死的一種方法已有30余年歷史。其通過(guò)降低骨內(nèi)高壓，排出壞死組織，刺激加壓孔周圍的血管形成，增強(qiáng)壞死骨的爬行替代，使壞死灶得以消除［15］。本研究中髓芯減壓術(shù)在一定程度上降低了股骨頭壞死的發(fā)生率，但是作用有限，聯(lián)合生骨再造丸能改善股骨頭血液循環(huán)，有效增加股骨頭骨密度，提高骨強(qiáng)度，阻止股骨頭變形，較單一采用髓芯減壓術(shù)效果明顯。

本研究通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織病理學(xué)及骨組織BMP-2及VEGF mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，生骨再造丸能夠有效促進(jìn)家兔股骨頭壞死部位骨組織沉積，減少空陷窩率，并上調(diào)BMP-2及VEGF mRNA在骨組織中的表達(dá)。提示生骨再造丸可能通過(guò)提高BMP-2及VEGF表達(dá)，促進(jìn)股骨頭血管新生和改善其血液循環(huán)從而起到防治激素性股骨頭壞死的作用，為臨床治療該病提供了新的理論依據(jù)。