葡萄籽中原花青素抗肺癌作用機制研究進展

韓何丹 王海 高麗萍

[摘要]葡萄籽原花青素是由兒茶素和表兒茶素組成的低聚或高聚多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、清除自由基、抗腫瘤等多種生物學活性，因此，對于葡萄籽原花青素在誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期、調控信號分子等方面抗肺癌作用機制的研究進展進行了綜述。

[關鍵詞]葡萄籽原花青素；肺癌；細胞凋亡；細胞周期

[中圖分類號]Q 946836[文獻標志碼]A[文章編號]10050310（2018）01005005

Research Progress on Antilung Cancer Mechanism of

Grape Seed Proanthocyanidins

Han Hedan， Wang Hai， Gao Liping

（College of Biochemical Engineering， Beijing Union University， Beijing 100023，China）

Abstract： Grape seed proanthocyanidins is oligomeric or polymeric polyphenolic compounds， consisting of catechin and epicatechin with antioxidant， scavenging free radicals， antiinflammatory， antitumor and other biological activities. This paper summarized the research progress on antilung cancer mechanism of grape seed proanthocyanidins aboutproapoptotic effect， cell cycle arrest， progress in regulation of signaling molecules.

Keywords： Grape seed proanthocyanidins； Lung cancer； Apoptosis； Cell cycle

近年來，腫瘤的發病率逐年增高，尤其是肺癌，在惡性腫瘤中已居首位。盡管在過去的幾十年間，醫療取得了較大的進步，但在我國，肺癌的5年存活率仍不足15%，在其他國家也是首位的癌癥致死原因。因此，人們迫切需要找到新的腫瘤治療手段。目前大約有2 000多種天然與合成的化學物質在特定的臨床前研究中表現出化學預防和治療作用。原花青素是一大類可從植物中提取的、有多種生物活性功能的多酚化合物[1]。其中以葡萄籽中含量最高，葡萄籽中原花青素的提取量可達205%[23]。研究發現，葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins， GSP）抗肺癌的效果良好。

1GSP簡介

11葡萄籽原花青素的成分和結構

葡萄籽原花青素的成分主要是黃烷醇及其低聚物等黃酮類化合物，由以下4種基本結構組成：（+）—兒茶素、（-）—表兒茶素、（-）—表兒茶素沒食子酸以及沒食子酸酯。GSP中這4種結構的單體形式只占100%左右，此外，主要通過C4C6或C4C8連接形成二、三、四聚體的形式出現，最高聚合度為15。根據聚合度的不同，葡萄籽原花青素又分為高聚葡萄籽原花青素（polymeric grape seed proathocyanidins， PGSP）和低聚葡萄籽原花青素（oligomeric grape seed proathocyanidins， OGSP）。其中生物活性最強的是OGSP[46]。

12GSP的生物學活性

經過大量的研究證實，GSP具有極強的清除自由基和抗氧化活性、抗疲勞、抗輻射損傷、延緩衰老、心血管保護作用及抗高血糖、抗腫瘤、抗誘變等作用[7]。它是目前公認的抗氧化能力最強的天然抗氧化劑之一。在同等條件下，GSP的氧自由基清除能力是維生素C （VC）的5～6倍。通過建立生物膜模型檢測OGSP和維生素E （VE）的抗氧化能力時，發現原花青素較VE能有效延長羥基自由基誘導的卵磷脂脂質體過氧化作用，而當GSP和VE聯合使用時，發現二者具有明顯的協同作用，可以大大加強抗氧化作用。原花青素的清除自由基和抗氧化能力是目前被應用得最多的方面，其作用主要表現在：1）有效地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基等，也可中斷自由基鏈式反應；2）參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質磷酸化，保護脂質不發生過氧化損傷；3）為強有力的金屬螯合劑，可螯合金屬離子，在體內形成惰性化合物；4）保護和穩定維生素C（VC），并有助于VC的吸收。

13葡萄籽原花青素的生物利用度

從葡萄籽中提取的原花青素屬于生物類黃酮，其水溶性好，有效性高，其中低聚原花青素的生物利用度在90%以上，極易被人體吸收[6]。有研究通過給小鼠灌胃和大鼠腹腔注射14C標記的原花青素，發現原花青素在胃腸道中吸收速度快，在45 min時達到吸收的最高峰，半衰期為5 h，有14%的原花青素在11 h內經過膽汁排出體外[8]。

北京聯合大學學報2018年1月

第32卷第1期韓何丹等：葡萄籽中原花青素抗肺癌作用機制研究進展

14葡萄籽原花青素的安全性

毒理研究報道，給大鼠和小鼠口服葡萄籽原花青素，測得的半數致死劑量（LD50）均在4 000 mg/kg以上。Yamakoshi等研究報道多聚體葡萄籽原花青素在急性毒性劑量（2 g/kg、4 g/kg）和90天慢性毒性劑量（002%、02%、2%）下未見不良反應，無可見有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level， NOAEL）為2%，相當于男性1 410 mg/（kg·d），女性1 501 mg/（kg·d）[9]。微核實驗[2 000 mg/（kg·d）]、Ames實驗（5 000 μg/平板）結果顯示，葡萄籽原花青素無致畸和致突變作用[10]。

2葡萄籽原花青素抗肺癌作用機制

21促進肺癌細胞凋亡

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主、有序的死亡。近年來學者提出，由外界刺激造成DNA損傷而誘發的細胞凋亡分子機制主要包括3條途徑，即線粒體途徑、內質網途徑和死亡受體途徑，且各途徑之間是緊密聯系和相互作用的[11]。細胞凋亡途徑在抗腫瘤藥物研究過程中發揮著重要的作用，因為細胞凋亡是大多數抗腫瘤藥物發揮抗腫瘤效應機制之一。

張國瑜等以不同濃度的葡萄籽原花青素與人肺腺癌A549細胞在體外共同培養，結果表明原花青素在25～250 μg/mL范圍內可呈時間和劑量依賴性地抑制A549細胞的增殖[12]。Hoechst33258染色觀察凋亡細胞形態學表現為染色質凝集、細胞核破裂成碎片等細胞凋亡特征性變化。通過TUNEL法檢測細胞凋亡，發現0、25、25、250 μmol/L濃度原花青素組的細胞凋亡率分別為625%、1674%、1847%、2414%。另外，張國瑜等還發現25 mg/L和250 mg/L

質量濃度的原花青素作用A549細胞24 h，瓊脂糖凝膠電泳可見凋亡細胞典型的梯狀DNA條帶，Caspase9、Caspase3蛋白表達量與花青素濃度成正相關，Bcl-2蛋白表達量與花青素濃度則成負相關，結果表明原花青素可通過線粒途徑誘導細胞凋亡[13]。

高愛霞等將人大細胞肺癌細胞NCIH460在含不同濃度原花青素的培養液中培養24 h、48 h、72 h，結果表明，花青素對細胞增殖有顯著抑制作用，呈劑量—時間依賴性。DNA瓊脂糖凝膠電泳在50、100、200 μg/mL花青素組能檢測到明顯降解的梯形條帶，對照組和25 μg/mL組沒有凋亡條帶[14]。另外，高愛霞在Hoechst33258熒光染色實驗中發現正常組和25 μg/mL花青素組細胞核為均勻藍色，50、100、200 μg/mL花青素組染色致密發亮且有部分細胞核斷裂成碎片的凋亡細胞。流式細胞術檢測25、50、100、200 μg/mL花青素對NCIH460細胞的凋亡率分別為13%、20%、117%和278%，明顯高于對照組[15]。

22阻滯肺癌細胞周期

細胞周期在細胞增殖與凋亡中起著重要的作用。細胞周期可分為G0/G1、S、G2/M三個階段，其中G1期與G2期進行RNA的復制與有關蛋白質的合成，S期進行DNA的復制，因此

，S期是完成遺傳信息復制的最重要的階段。阻滯細胞周期由G1期到S期的過渡是抑制腫瘤細胞增殖的有效方法和治愈癌癥的重要前提條件。

參與細胞周期調控的因子有：細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase， CDK）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclindependent kinase inhibitor， CKI）、視網膜神經膠質瘤蛋白（Rb）。CKI為新發現的一類蛋白，通過與CDK、Cyclin或CyclinCDK復合物的結合，抑制CDK的激酶活性，從而調節細胞周期正常有序地進行。視網膜神經膠質瘤蛋白Rb是一種抑癌基因表達的蛋白，可以通過調控細胞周期G1期的檢驗點來調節細胞增殖，Rb蛋白的活性由其磷酸化水平來調控。

根據王海等的研究報道，5 mg/L的順鉑（DDP）可以引起A549細胞S期阻滯，4 mg/L的OGSP能夠引起A549細胞G0/G1期阻滯，兩者聯用既能形成G0/G1期阻滯，又能形成S期阻滯。OGSP單獨處理可以顯著降低Cyclin D1和CDK4蛋白水平，并能夠顯著降低DDP引起的pRb蛋白水平的升高[16]。張小芳在GSP對肺腺癌SPCA-1細胞X射線放療的增敏作用的研究中發現，GSP對肺癌SPCA-1細胞有較好的放療增敏作用，增敏劑量在50～100 μg/mL之間，GSP能使G0/G1期細胞比例明顯增加，S期和G2/M期減少，促進細胞的凋亡[17]。

23調控信號分子

231VEGF

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）又稱血管通透因子（vascular permeability factor， VPF），是胎兒和成人血管生成和血管生長過程中重要的調控因子。VEGF是特異性作用于內皮細胞的糖基化細胞有絲分裂素，在增強血管的滲透性、誘導血管生成和血管生長及內皮細胞生長、促進細胞遷移、抑制細胞凋亡等方面發揮作用。癌細胞的生長、轉移依賴新生血管的形成，VEGF是最有效的促血管生長因子。以VEGF及其受體VEGFR為靶點治療癌癥是藥物研究的熱點。

陳聶等在探討GSP對大鼠肺纖維化的治療作用的研究中發現，用博萊霉素誘導大鼠實驗性肺纖維化后，大鼠肺組織VEGF和VEGFR1蛋白及mRNA含量均明顯高于正常對照組，而GSP組中VEGF和VEGFR1蛋白及mRNA含量均明顯低于模型組，且給予GSP 7天和14天，VEGFR1和mRNA的表達依然低于模型組[18]。因此，GSP可有效抑制VEGF和VEGFR1的表達來抑制肺組織病理性血管生成，從而起到抗肺纖維化的作用。

232EGFR

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）是一種廣泛分布于人體各組織細胞膜上的多功能糖蛋白，是原癌基因cerbB-1的表達產物，EGFR 及其配體是細胞信號傳導系統的一部分。研究表明，EGFR基因拷貝數增加或者過度表達，均能促進正常細胞的轉化和惡性腫瘤的轉移。Castanon等和Sette等發現在健康人肺組織中EGFR呈現低表達或不表達狀態，而在超過60%以上肺癌患者中存在過表達[1920]。因此，EGFR的信號傳導網絡在腫瘤的形成和發展過程中起重要作用。

EGFR的信號傳導關乎細胞的凋亡、增殖、分化、遷移和細胞周期循環，與腫瘤的形成和惡化息息相關。周也涵等研究GSP對肺癌A549細胞的侵襲和遷移的實驗結果表明，GSP以劑量依賴的方式抑制A549細胞的增殖，并顯著降低EGFR的蛋白表達，導致細胞遷移和遷移能力明顯下降[21]。

233GST-π

谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione stransferase，GST）是廣泛分布于各種生物體內的一組多功能同工酶[22]，是體內生物轉化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統。其主要功能是催化某些內源性或外來有害物質的親電子基團與還原性谷胱甘肽的巰基偶聯，增加其疏水性，使其易于穿越細胞膜，并在被分解后排出體外，從而達到解毒的目的[2325]。依GST同工酶亞基結構和等電點的不同，將GST分為α、θ、μ、π和σ五種[26]，π類谷胱甘肽S轉移酶（GSTπ）的作用大于其他同工酶類，與人類腫瘤關系密切[2728]。近年來的實驗研究表明，GSTπ在腫瘤細胞惡性生物學行為出現之前就可表現出表達的異常升高，形成酶變灶或酶變細胞，參與腫瘤的遷延、轉移等惡性生物學行為。涂靜以非小細胞肺癌細胞NSCLC為研究對象，發現花青素可以減少NSCLC細胞GSTπ的mRNA含量和蛋白表達，可降低由GSTπ高表達帶來遷延轉移多藥耐藥等生物學行為，有助于肺癌的臨床化療[29]。

234COX2

環氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成所必須的酶。目前發現細胞中至少有兩種COX的編碼基因，即COX1和COX2兩種亞型。COX1和COX2具有61%的同源性，但卻表現出明顯的功能差異。COX2主要分布在細胞膜上，其表達調控主要集中在轉錄水平，COX2與炎癥和腫瘤的發生關系密切。在生理狀態下，COX2在大多數組織中不表達或微表達，但在正常組織癌變以及癌細胞增殖過程中均會過量表達，故該基因的表達可能與腫瘤的發生和惡化有關[3031]。動物實驗發現[32]，COX2的表達會增加前列腺素E2（PGE2）的合成，PGE2可誘導細胞增殖并刺激BcL2蛋白表達，而后者抑制細胞凋亡，從而促進腫瘤的發展。

盧婷婷和梁統以白介素1β（IL1β）誘導的人肺癌細胞A549為模型，研究原花青素對環氧合酶2（COX2）啟動子活性的影響[33]。此試驗中用含完整的和NFκB結合位點突變的COX2啟動子的熒光素酶表達載體pGL3質粒轉染 A549細胞。實驗組加原花青素（20 μg/mL）培養，對照組加01% DMSO。結果顯示，未加原花青素的含完整COX2啟動子的A549細胞 COX2啟動子活性經IL1β誘導后活性明顯增高，而NFκB結合位點突變的COX2啟動子活性很低，且經IL1β誘導后活性無明顯變化。20 μg/mL原花青素作用下IL1β誘導產生的完整COX2活性較未經原花青素組有顯著降低，即原花青素對COX2的啟動子活性有明顯的抑制作用。

3結束語

肺癌作為人類發病率最高的癌癥，嚴重威脅著人類的生命健康，人們不僅需要積極探索研發更有效的治療方法，也應該重視對肺癌的預防和早期診斷，降低肺癌的發病率，有效地降低肺癌對人類的危害。國內外大量的研究結果對葡萄籽原花青素的抗腫瘤作用都作出了肯定，且相對于現在常用的治療方式，葡萄籽原花青素對人體正常細胞并無毒副作用，這就為原花青素在肺癌的預防和治療中的應用打下了基礎。但是目前對原花青素的研究還僅局限于體外實驗或動物實驗，對其在人體上的抗肺癌作用還少見相關研究報道，所以對葡萄籽原花青素在人體的抗肺癌應用還需要進一步研究。就目前關于葡萄籽原花青素的研究成果而言，它將是很有潛力的抗肺癌藥物。[參考文獻]

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（責任編輯李亞青）