結直腸癌的分子分型及精準醫學時代展望

孫玉琳 趙曉航

1990年，Fearon和Vogelstein提出了結直腸癌（colorectal cancer，CRC）癌變的多步驟、多階段遺傳演進模型。在這一模型中，最早出現的是正常結腸黏膜中抑癌基因APC（adenomatous polyposis coli）的失活突變，誘導癌前狀態腺瘤的產生，隨后是癌基因KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）的激活突變，以及SMAD4（SMAD family member 4）和 TP53（tumor protein p53）等基因的依次突變，使得腺瘤逐漸發展為癌［1-2］。這一模型因此也被稱作“腺瘤——癌序貫模型”（adenoma–carcinoma sequence model）。這些基因的累積突變通過調節細胞增殖、分化和凋亡通路從而驅動結直腸細胞的癌變，如Wnt-β-catenin、TGF-β、PI3K、TP53、EGFR和下游的RAS-MAPK通路等［2-3］。

“腺瘤——癌序貫模型”真的能夠完全解釋散發型CRC的癌變機理和臨床病理特征嗎？人們前期發現，某些患者的CRC腫瘤中不具有或僅存在一條上述驅動性通路的改變，但是卻具有顯著的染色體異常和/或表觀遺傳學改變［3］，這提示驅動性通路活化在這些腫瘤的癌變過程中并不是必需的。但是由于缺乏可控的培養系統或動物模型，驅動性通路突變在人類CRC癌變中的具體作用非常難以評價。2011年，Sato等［4］開發了一種人類上皮細胞類器官體培養系統，利用人小腸干細胞（intestinal stem cells，ISCs）自我更新的能力，通過添加模擬干細胞龕微環境的各種因子，使ISCs在Matrigel中形成腸隱窩樣類器官結構。2015年，他們進一步使用CRISPR-Cas 9基因組編輯技術，在正常人ISCs中依次突變掉APC、SMAD4、TP53、KRAS、PI3KCA基因，模擬了人類CRC中驅動性通路的活化狀態，發現這種工程化類器官體的生長不再完全依賴于干細胞龕微環境因子，表明僅僅突變掉5個驅動基因的ISCs完全可以起始腫瘤的發生。但是將這種類器官體注射到小鼠脾臟，卻僅能在肝臟形成微轉移灶（＜1 mm2）而無法形成肉眼轉移灶，表明這種細胞的侵襲、轉移能力有缺陷。進一步分析發現，這種類器官體細胞不具有其他的遺傳異常，比如染色體異倍性、拷貝數改變或CpG島甲基化表型等，其基因表達特征也跟人體CRC不完全一樣，病理表現為高分化形態。然而，當他們在腺瘤分離的ISCs細胞中，同樣突變掉這5個驅動基因后，經脾內注射即可形成大的肝內轉移灶，表明除了這5個驅動基因突變外，人體CRC還具有其他的遺傳特征［5］。那么腺瘤細胞跟正常結腸上皮細胞究竟哪里不同呢？最主要的區別是腺瘤細胞具有明顯的染色體異常，即染色體不穩定性（chromosome instability，CIN）。

另外，臨床上有一類特殊類型的腺瘤——無蒂鋸齒狀腺瘤（sessile serrated adenomas），這種腺瘤占結腸腺瘤的6～12%，好發于右半結腸，表現為寬的腔內鋸齒狀生長、結腸隱窩基部的分支和扭曲等特點，其癌變過程不完全遵循經典的“腺瘤——癌序貫模型”，反而表現為高頻的BRAF、尾型同源盒基因2（caudal type homeobox 2，CDX2）突變和表觀遺傳學異常［6-8］。這一癌變過程也被稱為鋸齒狀通路（serrated pathway），目前被認為是“腺瘤——癌序貫模型”的重要補充，約占全部CRC病例的15%左右［9］。因此，我們有必要全面地審視一下人體CRC細胞的遺傳和表觀遺傳學特征。

一、人體結直腸癌細胞的遺傳和表觀遺傳學特征

1. 高突變腫瘤的遺傳特征——微衛星不穩定 性（microsatellite instability，MSI）： 微 衛 星（microsatellite）是指基因組中廣泛存在的1～4 bp的串聯重復序列（重復次數通常在5～50次），人類基因組中平均每30 kb就有一個，其在DNA復制過程中的突變率明顯高于其他DNA序列，因此在人群中具有高度的可變性和多態性，廣泛的用于人群遺傳學研究［10］。1992年，Perucho等［11］為了發現新的抑癌基因，用微衛星PCR分析了CRC和癌旁正常組織，發現一部分CRC腫瘤組織中的條帶變短，位置下移了，進一步分析發現，這是由重復序列的堿基缺失造成的。1993年，這種現象被命名為 MSI［12］。

遺傳性非息肉結直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC），也稱為Lynch綜合征，也具有典型的MSI特征。其表現為早發性（通常在20～30歲）的結直腸、子宮內膜、胃、卵巢等的多發腫瘤。1993年Lynch綜合征家系的遺傳連鎖分析，將致病基因定位到2p16的MSH2基因上［13-14］，從而將MSI與DNA錯配修復系統（DNA mismatch repair，MMR）聯系了起來。

近年來的高通量測序研究發現，大約85%的CRC中，平均每個腫瘤有60個突變，而其余15%的CRC中，平均每個腫瘤有高達700個以上的突變，這部分腫瘤又被稱作高突變腫瘤［7，15］。進一步根據突變產生機理的不同，將高突變腫瘤又分成兩個亞類［16］，第一個亞類約占高突變腫瘤的80%，突變率為15～40位點/Mb DNA序列，主要是由MMR系統缺陷造成的［17］；第二個亞類約占高突變腫瘤的20%，其突變率在40位點/Mb DNA序列以上，又被稱為超高突變腫瘤，主要是由DNA聚合酶ε（POLE）的外切酶活性結構域失活突變，導致校對功能缺失引起的，個別腫瘤還可由POLD1的校對功能缺陷引起［18］。

人類MMR系統包括9個基因——MSH2、MSH6、MSH5、MSH4、MSH3、MLH1、MLH3、PMS1 和PMS2。其中MSH2-MSH6、MSH2-MSH3組成的異源二聚體沿著新合成DNA鏈移動，識別DNA復制過程中的單堿基錯配、小的插入/缺失錯配環（insertion-deletion loop），并招募MLH1-MLH3、MLH1-PMS2、MLH1-PMS1等復合物切除錯配并修復［19］。因此這一系統是生物體內DNA復制后的一種重要修復機制，在保證DNA復制的忠實性、維持遺傳的完整性和穩定性方面具有重要作用。

Lynch綜合征是由MMR基因的種系失活突變引起的遺傳性疾病，目前公認的基因有4個，MSH2、MLH1、MSH6和 PMS2［20］。而大約 12%的散發型CRC有MMR缺陷引起的MSI，主要是由MLH1和PMS2蛋白的表達缺失引起。這類腫瘤中還常見MLH1基因啟動子的雙等位基因甲基化、高頻的BRAF基因突變（通常在V600E位點），74%的腫瘤表現為二倍體。腫瘤還具有較為鮮明的臨床病理特征，好發于右半結腸，表現為低分化、粘液型或印戒樣形態，可見大量的T細胞浸潤，患者預后好于其他非MSI的患者。

2. 染色體不穩定性（chromosome instability，CIN）：CIN是指由于有絲分裂過程中染色體的錯誤分離引起高頻的整條或部分染色體獲得或缺失，由此導致不同子代細胞之間的核型異常［21］。最主要的表現是染色體數量的異常（異倍體）、部分染色體的擴增和高頻的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）。造成CIN的原因目前還不完全清楚，但已知與染色體分離缺陷、端粒失功能、DNA損傷反應相關基因異常有關［22-23］。

CIN可見于65%～70%的散發性CRC，也是與“腺瘤——癌序貫模型”契合度最高的。CIN相關的CRC中常見多種癌基因和抑癌基因的累積突變，驅動基因APC、KRAS、SMAD4、PIK3CA和TP53在CIN相關CRC中的突變率分別為30%～70%、30%～50%、10%～20%、20% 和40%～50%［22］。那么CIN到底是細胞癌變的原因還是結果呢？目前認為，CIN在“腺瘤——癌序貫”通路的很早階段就已發生，60%～80%的結腸息肉存在異倍體改變［24］。而APC基因的突變在CIN的形成過程中可能發揮始動作用，因為其除了在Wnt/β-catenin信號通路中發揮中心作用外，通過結合胞漿、紡錘體、中心體微管的正端，在細胞骨架調控中也發揮重要作用［22］。

具有CIN特征的CRC患者，無論種族、腫瘤的解剖部位、是否接受化療等，比起具有MSI特征的患者，都具有較差的總生存和無進展生存率［22］。但是，由于具有典型的“腺瘤——癌序貫”癌變通路，因此為CRC的化學預防提供了機會。比如使用選擇性的COX-2抑制劑可減少息肉的復發并降低CRC發生率，但卻增加心血管病和腎性高血壓的風險［25-27］。

3. CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）：CIMP這一概念最早是由Toyata等［28］于1999年提出的，是指全基因組范圍內，大量基因啟動子區CpG島自發性高甲基化的現象，導致多個抑癌基因或其他腫瘤相關基因的失活，反映了一種表觀遺傳學不穩定的狀態。超過50%的人類基因表達可以通過啟動子區CpG島的甲基化狀態來調節。與CRC有關的甲基化有兩種：A型甲基化（又稱年齡相關的甲基化）和C型甲基化（又稱腫瘤特異的甲基化）［29］。A型甲基化與正常結直腸上皮細胞的衰老有關，受累基因多調控細胞的生長和/或分化，導致細胞癌變的易感狀態。C型甲基化僅僅出現在腫瘤中，表現為CIMP。

CIMP相關的CRC同樣具有鮮明的特征，30%～40%的右半結腸腫瘤和5%～15%的左半結腸和直腸腫瘤表現為CIMP，常見于女性、高齡、吸煙患者，病理以粘液型和低分化為主，而且腫瘤具有高頻的BRAF基因突變［29-31］。但是CIMP對于患者預后的影響目前還存在爭議，目前認為在去除其他臨床因素和相關突變的影響后，CIMP與CRC患者的預后沒有明顯相關性［29，32］。

4. CRC腫瘤中可能同時共存多種遺傳或表觀遺傳學特征：上述三個CRC癌變通路并不是完全互斥的，某些腫瘤中可同時存在多種特征，比如雖然大部分微衛星穩定的腫瘤是通過CIN通路癌變的，但大約25%的MSI相關CRC同時存在CIN表型，12%的CIN陽性的腫瘤同時存在高水平的MSI［33-34］。另外，CIMP常見于MSI陽性/CIN陰性的腫瘤，但大約33%的CIMP相關的CRC同時存在高水平的CIN［35］。

二、CRC的基因分型

由于不同癌變通路的CRC具有不同的臨床病理特征，甚至是不同的預后和治療反應性，因此隨著個體化醫學（personalized medicine）的發展，人們對CRC精準分子分型的需求越來越迫切。從2007年開始，科學家就嘗試進行CRC的分子分型［36］。隨著基因組學、轉錄組學及高通量測序等技術的發展，從2012年起，基于不同基因表達譜分析平臺和分析方法的多個CRC分型系統相繼被報道［3，37-43］。不同的分型系統之間有一定的相似性，比如MSI相關的腫瘤和間質基因高表達的腫瘤都被單獨的分了出來，但是同樣也存在很大的差異，不便于使用。為了規范CRC的基因分子分型，2015年，國際結直腸癌分型協作組（The CRC Subtyping Consortium，CRCSC）綜合了六套CRC分型數據［37，39-43］，開發了一套基于網絡生物學的整合性分型算法，建立了4種CRC分子特征共識分型（consensus molecular subtype，CMS）——CMS1、CMS2、CMS3和 CMS4（表 1）［44］。四種分型在參與分析的近4 000例腫瘤中所占的比例分別是14%、37%、13%和23%，其余的是無共有特征性腫瘤，不具有任何一致性的特征，占到了全部原發性腫瘤的22%。

CMS1型又被稱為MSI免疫型，表現為高的MSI和CIMP，低的CIN和強免疫原性。近70%的BRAF突變的患者都集中在這一型中。雖然高MSI的典型特征是高的基因突變率，但是除BRAF之外的其它常見CRC驅動基因，比如APC、TP53、KRAS、PIK3CA等的突變頻率并不比其他類型高。這一類型腫瘤中常見的活化通路有JAK-STAT通路、Caspases通路等。腫瘤中常見免疫細胞的彌漫性浸潤，主要為Th1細胞、細胞毒T細胞和NK細胞等；而且CTLA4、PD1、PDL1等免疫檢測點分子高表達，具有高免疫原性，因此總生存和無進展生存較好，也是免疫檢測點藥物治療的適宜人群。但此類患者一旦復發，其預后很差［44-45］。

表1 CRC分子特征共識分型（CMS）的生物學和臨床病理特征

CMS2型又被稱為經典型，表現為高CIN、低CIMP和MSI特征，因此腫瘤具有典型的上皮分化特征，并存在大量的體細胞拷貝數改變（somatic copy number alterations，SCNAs）。比較特征性的是這一類型中15%的患者都具有HNF4A基因的擴增，而且Wnt和Myc靶基因，以及很多癌基因如EGFR、ERBB2 （Her2）、IGF2、IRS2、HNF4A和cyclins等過表達。常見的活化通路有EGFR和SRC通路、Wnt和Myc通路等。另外，此類腫瘤的免疫原性較低，但患者整體預后較好，即使是在腫瘤復發以后，其預后也優于其他類型的腫瘤［44-45］。

CMS3型又被稱為代謝型，表現為中等程度的CIN和CIMP，30%的個體還具有MSI特征，KRAS突變的患者也在此型中相對富集。此型患者最突出的特征是細胞代謝譜的改變和代謝重編程，各種糖、脂、氨基酸、核苷酸代謝均處于活躍狀態，尤其是谷氨酰胺分解和脂肪生成通路異常活化。CMS3型腫瘤的免疫原性同樣較低，但患者整體預后較好［44-45］。

CMS4型又被稱為間質型，表現為高CIN、低MSI和CIMP，它與CMS2型的主要區別是癌旁組織中有大量的基質細胞，如腫瘤相關成纖維細 胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）； 腫瘤組織中也有大量的炎癥細胞浸潤，如Treg細胞、髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、單核細胞和Th17細胞等。由于CAFs分泌高水平的TGF-β，而炎癥細胞產生大量的炎癥和免疫抑制因子，如CXCL12、CCL2、IL-23和IL-17等，因此表現出促轉移的免疫逃逸微環境。另外，TGF-β信號通路以及上皮間葉轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、整合素通路、VEGF和VEGFR通路、細胞外基質重塑和補體介導的炎癥通路等均在此型中處于活化狀態，因此患者的預后很差［44-45］。

此外，這四種分型的CRC也具有較為鮮明的臨床病理特征（表1）［44-45］。CMS1型更常見于女性患者，腫瘤多位于右半結腸，直腸癌罕見，病理上多表現為中、低分化的實性和/或管狀或粘液型；CMS2型多位于左半結腸，直腸癌所占比例較高，病理上多表現為中、高分化的復雜管狀結構；CMS3型多位于右半結腸，病理上多表現為中、高分化的乳頭狀腫瘤；CMS4型中直腸癌所占比例較高，患者診斷時多為晚期，病理上多表現為中、低分化，并伴有高間質結締組織增生反應。值得一提的是，絕大部分的直腸癌均為CMS2和CMS4型。

另外，通過對比管狀腺瘤和無蒂鋸齒狀腺瘤的基因表達譜發現，無蒂鋸齒狀腺瘤中，TGF-β通路活化，依TGF-β通路活化程度的不同，可分別進展為CMS1和CMS4型腫瘤。通過BRAF激活突變建立的無蒂鋸齒狀腺瘤類器官體模型中，結合微環境中的高水平TGF-β信號，可直接驅動間質型CMS4樣腫瘤的形成［46］。

三、CRC的蛋白質組分型

蛋白質是生命功能的最終執行者，也是聯系基因型和表型的紐帶。腫瘤相關的基因組和表觀遺傳學改變能否最終體現在蛋白質層面上，并指導患者分子分型？2014年臨床腫瘤蛋白質組分析聯盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）首先在CRC上對實體瘤的蛋白質組分型做了嘗試［47］。他們對95對TCGA腫瘤組織樣本進行了深度蛋白質組分析，平均每個樣本鑒定到7 211個蛋白。與TCGA基因組和轉錄組測序數據的對比發現，比起種系DNA突變來，腫瘤組織內的體細胞突變更傾向于減少蛋白豐度，可能是因為降低了基因的翻譯效率和蛋白穩定性。而拷貝數變異通常強烈影響mRNA的豐度，對蛋白豐度的影響則較弱。因此，mRNA和蛋白豐度的相關性較低，平均的Spearman相關系數只有0.23。這提示基因組和表觀基因組的異常不一定能反映到蛋白層面上。

根據這些CRC患者腫瘤組織的蛋白質組表達特征，可以分成5個亞型——蛋白質組亞型A～E（表2）［47］。與基因組和表觀基因組特征的比較發現，幾乎所有高突變腫瘤都集中在亞型B和C中，亞型B中罕見TP53的突變和18q缺失，但明顯與高CIMP表型相關，而亞型C中明顯富集非CIMP表型個體和干細胞樣特征。其余的三個亞型A、D和E，則與CIN特征相關，亞型E中明顯富集TP53突變和18q缺失的個體，還與HNF4A擴增和高表達相關。

臨床病理特征相關性分析顯示，亞型C中明顯富集II期腫瘤。標志蛋白的基因功能分析發現，亞型C的上調蛋白中明顯富集于創傷反應、蛋白激活級聯EMT相關的蛋白；亞型E的上調蛋白中明顯富集于RNA代謝加工通路中。因此，亞型C與患者的不良預后相關。

雖然蛋白質組分型與CMS基因分型并不一致，但兩者之間具有關聯性［44］。比如，蛋白質組亞型A的個體主要富集在CMS2基因分型中；亞型B主要富集在CMS1型中；亞型C主要富集在CMS4型中；亞型D主要富集于CMS3亞型中；而亞型E主要富集在CMS2中。

表2 CRC蛋白質組分型的生物學和臨床病理特征

四、CRC分子分型在精準醫學診療中的意義

晚期CRC的靶向治療開始于2004年，當時人們并沒有考慮CRC本身的遺傳特征，僅將腫瘤的共有特征——新生血管形成（angiogenesis）的關鍵基因VEGF作為治療靶點［48］。隨著對CRC分子癌變通路和遺傳特征的認識，2009年起，標準化療方案聯合抗EGFR單抗（西妥昔單抗或帕尼單抗）的三期臨床試驗顯示，KRAS基因野生型的患者對抗EGFR單抗的靶向治療敏感，而KRAS第2外顯子突變的個體對抗EGFR單抗原發耐藥［49-50］。針對KRAS基因突變的分層模型開啟了CRC精準治療的時代，這一階段也稱為“單基因——單藥物”模式［45］。

然而，多數KRAS基因野生型患者對西妥昔單抗和帕尼單抗同樣不敏感，表明還存在其他的耐藥機制。而且，其他單一靶向藥物（如針對BRAF突變個體的BRAF抑制劑和針對KRAS突變個體的MEK抑制劑）的臨床試驗相繼失敗，提示針對單一位點的靶向治療還存在一些弊端［51-52］。

高通量測序技術的發展推動CRC的精準靶向治療進入“多基因——多藥物”模式［45］。人們發現對EGFR抑制劑原發性耐藥的腫瘤還受其他通路的影響，比如BRAF、MEK1、ERBB2、FGFR1和PDGFRA等［53］。而KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA均為野生型的腫瘤（也稱四陰性腫瘤，約占CRC患者的30%），對EGFR抑制劑的治療反應性更好［54］。四陰性腫瘤對靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）聯合抗EGFR單抗的雙重治療特別敏感，這兩種藥物通過不同機制抑制EGFR，對于EGFR胞外結構域突變的腫瘤，雙重EGFR靶向治療同樣有效［55-56］。另外，在四陰性腫瘤的患者源性異種移植模型（patient-derived xenograft，PDX）中，同時抑制EGFR和MEK能明顯減少獲得性耐藥［57］。對于RAS野生型的腫瘤，盡早給予EGFR和MEK抑制劑治療，能顯著增加這條信號通路完全阻斷的機會，減少獲得性耐藥。

對CRC分型認識的不斷深入，使人們意識到不同CMS亞型具有顯著的生物學差異，因此也會導致不同的藥物反應性。CMS2型腫瘤因為具有EGFR配體和IRS2的高頻擴增和/或過表達，抗EGFR靶向治療通常可延長患者生存時間，而CMS1和CMS3型腫瘤的EGFR通路通常處于低活性或抑制狀態，對抗EGFR靶向治療無效［44，58］。另外，CMS2型腫瘤中還存在ERBB2和IGF2基因的擴增，因此聯合使用ERBB和IGF1R的抑制劑可能會有更好的效果［59］。CMS1型腫瘤因為有強的免疫原性，高表達CTLA4、PD1、PDL1等免疫檢測點分子，可能是PD1抗體治療的適宜人群［44］。此外，CMS4型腫瘤中雖然RAS基因多為野生型，但是由于細胞呈現間葉細胞表型，因此對抗EGFR治療產生治療原發性耐藥［44］。但聯用西妥昔單抗和抗integrin-αv的單抗將使高表達integrin-αvβ6的CMS4型腫瘤患者獲益［60］。針對CMS3型腫瘤，靶向代謝酶，如谷氨酰胺酶和脂肪酸合酶的新型抑制劑，正在研發階段［61-62］。但是，針對不同CRC分型的分子基礎，聯合使用不同的靶向治療策略，即“多分子——多藥物”模式，正是未來CRC精準醫學的核心［45］。

CRC的發生發展是一個漫長的生物學過程，涉及基因組、表觀遺傳組、轉錄組、蛋白質組，乃至代謝組等各個層面的大量基因、蛋白和小分子代謝物及其交互網絡的異常改變。但是，現有的CRC分子分型系統還有賴于驅動基因突變檢測、轉錄組和蛋白質組分析，受技術方法、數據分析和費用等因素的限制還難以大范圍地應用于臨床。相信隨著對CRC分子癌變基礎認識的不斷深入，以及分型算法、工具的不斷簡化，CRC的精準分子分型必將在其精準診治中發揮更加重要的作用。