長非編碼RNA H19在結直腸癌化療敏感性中的作用研究

王秀梅 趙海平 秦瓊 劉永強 張兵 武永勝

結直腸癌是發病率較高的腸癌之一，據研究調查顯示，男性結直腸癌發病占惡性腫瘤發病率第三位、女性結直腸癌發病率居第二位。同其它惡性腫瘤一樣，結直腸癌發生和發展是環境和基因交互作用的結果，確切發生機制目前未完全闡明，研究顯示，大部分早期結直腸癌患者能通過手術治愈，但患者早期不易發現癥狀，出現癥狀時往往已被診斷為結腸癌晚期，導致化療效果較差，其預后情況不盡人意［1-3］。但有效的分子標記物缺乏及放化療帶來的副作用，致使化療效果并不理。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是200 bp以上且不能翻譯成蛋白質的RNA［4-5］，雖不能編碼蛋白質，但lncRNA具有諸多生物學作用如調控基因轉錄、修飾組蛋白等，在細胞核和細胞質中廣泛分布。隨著基因芯片等技術的應用，發現越來越多的lncRNA與結直腸癌發生和發展存在密切聯系，在結直腸癌的作用機制逐漸清晰［6］。目前仍不清楚lncRNA 對結直腸癌的化療效果影響［7］，H19 基因位于人染色體11p15.5，調控細胞生長等過程，研究表明 H19 在結直腸癌中可能具有癌基因和抑癌基因的雙重作用［8-9］。但目前尚未有資料研究H19基因對結直腸癌化療敏感性的影響。本研究擬探討H19基因調控結直腸癌化療敏感性機制。

資料和方法

一、主要材料和試劑

人結腸癌細胞系LoVo來自于中科院上海細胞所。RPMI1640培養基、胎牛血清（FBS）購自GIBCO 公司；轉染試劑脂質體2000購自Introgen（美國）公司；lncRNA H19 引物由上海生工生物合成。MDR1、MRP1、BCRP、bcl-2、bax等抗體均購自CST公司。選取2017年1～12月本院腫瘤科26例結直腸癌組織及相應癌旁組織，患者年齡43～78 歲，平均（63.65±14.17）歲，其中男 15 例，女11 例。標本全部經專業病理科人員指導采集并經病理切片證實。

二、方法

（一）細胞培養及轉染

在 RPMI1640培養液，于37 ℃、5% CO2、90% 濕度孵箱中貼壁培養結直腸癌細胞LoVo。根

據脂質體2000操作說明，將脂質體2000分別將H19siRNA、pcDNA-H19質粒及陰性對照載體轉染至LoVo細胞，構建lncRNA H19穩定過表達及表達沉默的結腸癌細胞株。

（二）MTT法檢測各組細胞對5-FU敏感性

各組分別加100 μL細胞至96孔板中。 每組加入5-Fu使終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、132 g/mL，各組細胞各個濃度設3個重復。5%CO2孵箱中培養48 h后，每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL）工作液，繼續培養4 h棄去培養液，再加入150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min，于自動酶標儀測定各孔450 nm處吸光度值。根據公式：抑制率=（1－實驗組平均 A值/對照組平均A 值）×100%，根據抑制率計算得到半數抑制濃度（IC50值）。

（三）劃痕實驗

細胞培養至細胞密度達到85%時，在培養孔垂直方向用槍頭輕輕劃過貼壁細胞層。用PBS洗去脫落細胞后繼續培養，分別于0 h、48 h時在顯微鏡下對劃痕拍攝，計算距離。

（四）RT-qPCR檢測lncRNA H19表達

Trizol法提取細胞總RNA。用TaqMan@MicroRNA Reverse Transcription kit進行反轉錄，反 應 總 體 系 為 10 μL。 用 TaqMan@MicroRNA Assays Realtime PCR試 劑 盒 檢 測lncRNA H19表達，以β-actin作為內標，lncRNA H19 F：5’-GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3’；R：5’-GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3’；β -actin F：5’- CCTGTACGCCAACACAGTGC - 3’；β-actin R：5’- ATACTCCT GCTTGCTGATCC -3’； 每組設三個重復，根據△△CT法對結果進行相對定量分析，根據各樣本的平均Ct 值，以 2-ΔΔCt表示mRNA相對表達水平，所有反應均在ABI7500實時定量PCR儀完成。

（五）Western blot

根據蛋白提取試劑盒操作步驟提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白總量。根據目的蛋白分子量，用合適濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離，繼而轉膜和封閉，稀釋一抗后放置在4 ℃冰箱過夜；用TBST洗滌3次，二抗孵育60 min后繼續TBST洗滌3次，化學發光后采集圖像。

三、統計學分析

經SPSS l9.0統計學軟件統計和分析數據，計量資料用平均數±標準差（）表示，用t檢驗計算兩組間差異，單因素方差分析計算多組間差異，P＜0.05表示差異有顯著統計學意義。

結 果

一、結直腸癌中lncRNA H19表達情況

采用實時熒光定量PCR方法檢測26例結直腸癌及對應的旁癌正常組織標本中lncRNA H19的表達水平。與旁癌組織相比，結直腸癌組織中lncRNA H19的相對表達量顯著增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 lncRNA H19在結直腸癌組織中高表達

二、lncRNA H19轉染效果

qRT-PCR檢測結果顯示，H19siRNA轉染后lncRNA H19表達顯著降低（P＜0.05），pcDNA-H19質粒轉染后lncRNA H19表達顯著上調（P＜0.05），空白對照無明顯變化。提示轉染效果良好，可用于后續實驗。見圖2。

三、結腸癌細胞株LoVo對5 -FU的化療敏感性差異

MTT實驗結果顯示，空白對照組LoVo細胞IC50為（52.31±4.32）μg/mL， 過 表 達 lncRNA H19后，IC50為（98.32±9.32）μg/mL， 提 示lncRNA H19上調可導致LoVo對5-FU的敏感性降低。干擾lncRNA H19 LoVo IC50為（31.21±2.12）μg/mL，提示lncRNA H19下調可導致LoVo對5-FU的敏感性增加。見圖3。

四、細胞遷移能力

圖2 lncRNA H19轉染

圖3 結腸癌細胞株LoVo對5-FU的化療敏感性

劃痕后48 h時，H19過表達后LoVo細胞的劃痕距離比陰性對照組（negative control，NC）大，差異具有顯著性統計學意義（t=4.542，P＜0.01）。H19干擾后LoVo細胞的劃痕距離比NC細胞小，差異具有顯著性統計意義（t=5.613，P＜0.01），見圖4。

五、Western blot檢測凋亡及耐藥蛋白水平

Western blotting 檢測不同轉染細胞后對凋亡蛋白BCL-2、Bax；耐藥蛋白MDR1、MRP1和BCRP表達，結果顯示H19過表達后LoVo細胞Bax蛋白表達下調，BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP蛋白表達上調，H19干擾后Bax蛋白表達上調，BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP蛋白表達下調，見圖5。

討 論

近期諸多研究證實，多種LncRNA在結直腸癌的發生、發展中扮演重要角色［10］。目前發現結直腸癌相關的主要LncRNA主要有H19、結腸癌相關轉錄物1、肺腺癌轉移相關轉錄本1、UCA1等。H19通過miRNA675和靶向蛋白質發揮作用［11-13］。5-FU作為結腸癌患者的一線化療用藥，其毒性較低，且抗腫瘤活性持續時間較長［14-16］。但隨著持續用藥，患者對5-FU逐漸產生耐藥性，化療藥物逐漸變得無效。深入研究H19表達對結腸癌患者耐藥的調控機制，可能為提高臨床療效提供支持［17］。

圖4 各組細胞遷移水平

圖5 蛋白表達印跡圖

本研究采用RT-PCR 的方法檢測26對結直腸癌組織及旁癌組織中lncRNA H19的表達，結果顯示lncRNA H19在結直腸癌組織中明顯上調（P＜0.05），與以往文獻研究結果一致［18］，為了進一步研究lncRNA H19對結直腸癌化療敏感性影響，本研究構建lncRNA H19干擾、過表達其空載對照的結腸癌細胞穩定株。通過RT-qPCR檢測轉染效果，干擾后和過表達LoVo細胞的lncRNA H19表達水平分別為相應對照組的0.45倍和1.54倍，提示轉染成功，可用于后續實驗，繼續用MTT實驗檢測不同處理后結直腸癌細胞的增殖，結果顯示過表達lncRNA H19后，LoVo細胞敏感性下降，而干擾lncRNA H19，敏感性增加，提示下調lncRNA H19可提高結直腸癌對5-FU的化療敏感性。用劃痕實驗檢測不同處理后腫瘤細胞遷移情況，發現H19表達下調能有效抑制LoVo細胞的遷移，為了進一步探討lncRNA H19對結直腸癌耐藥調控機制，本研究檢測不同處理后腫瘤細胞在5-FU培養中凋亡蛋白影響，結果顯示H19過表達后LoVo細胞Bax蛋白表達下調，BCL-2蛋白表達上調，H19干擾后Bax蛋白表達上調，BCL-2蛋白表達下調，提示干擾H19可以促進腫瘤細胞凋亡來影響細胞增殖和遷移，本研究繼續檢測細胞耐藥蛋白MDR1、MRP1和BCRP表達情況，結果發現干擾H19后MDR1、MRP1和BCRP者三類耐藥蛋白明顯下調，而過表達H19 MDR1、MRP1和BCRP者三類耐藥蛋白明顯上調，提示干擾H19提升化療敏感性可能與下調耐藥蛋白相關。

綜上所述，在結直腸癌中H19表達明顯增加，干擾H19后可明顯抑制細胞增殖和遷移和促進凋亡，提高5- FU敏感性，下調耐藥蛋白表達。但其在體內與體外的作用是否一致，還有待進一步研究，是潛在的結直腸癌治療靶點。