糖腎1號方含藥血清對高糖環境下培養的HK-2細胞中 TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白水平的影響*

王麗君，楊熙凱，徐 冰，趙 晰，王耀光

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300073）

隨著糖尿病腎病（DN）的患病率越來越高，DN進入終末期腎病（ESRD）的人數逐漸上升，DN給個人、家庭、社會都帶來了沉重負擔[1-2]。腎纖維化幾乎是所有慢性腎臟病進展為ESRD的共同途徑，其中以DN腎纖維化最為顯著[3]。隨著對DN研究的不斷深入，發現腎小管間質纖維化在DN進展中發揮著重要作用，延緩腎小管間質纖維化的研究對改善患者預后有重要意義[4]。目前干預DN腎纖維化主要從原發病入手，如控制血糖、調節血脂、改善腎臟血流動力學、保護腎功能等，而抗腎纖維化方面尚缺乏靶向藥物。傳統醫學注重整體觀念，在治療上主張“分期辨治，辨證論治，綜合治療”，中醫藥干預、治療DN具有較好療效，近年來越來越多的學者開始把研究方向指向中醫學。

糖腎1號方是王耀光教授治療DN的經驗方，在改善DN患者臨床癥狀、調節糖脂代謝、降低尿白蛋白方面具有良好的療效[5]。糖腎1號方早期動物實驗研究發現糖腎1號方對早期DN大鼠的尿蛋白及尿微量白蛋白有明顯改善作用，可增強機體氧自由基的清除能力，調節血清中炎癥介質，進而延緩腎小球硬化程度，減輕脂質過氧化程度而改善血管內皮細胞功能[6]。為了進一步探究糖腎1號方的作用機制，本實驗以高糖環境下誘導的人腎小管上皮細胞（HK-2）為研究模型，運用蛋白免疫印跡（Western blot）法和逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）方法檢測了轉化生長因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（FN），及調控基因的mRNA表達量。以期通過現代實驗室檢測手段，揭示糖腎1號方可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 本實驗所用的HK-2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠12只，體質量（250±10）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，大鼠飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所，普通飼料喂養。

1.3 實驗藥物 糖腎1號方：黃芪30 g，白術15 g，丹參 15 g，山藥 30 g，鬼箭羽 15 g，川芎 12 g，防風15 g，防己 15 g，萆薢 15 g，生地 12 g，石菖蒲 15 g，地龍12 g，天津中醫藥大學第一附屬醫院國藥堂提供，用時旋蒸濃縮，批號：2018002。

1.4 主要實驗試劑與儀器 MEM ALPHA細胞培養基（批號C12571500BT，Gibco公司）；胎牛血清（批號 sv30087.03，HyClone公司）；胰蛋白酶 1∶250（Genview，貨號：GP3108）；4-甲基偶氮唑藍（MTT，Beyotime公司），貨號/批號：C0009/081817171103）；TGF-β1、α-SMA、FN 抗體（Abcam 公司）；葡萄糖（批號201710102，天津市風船化學試劑科技有限公司），配制為30 mmol/L的溶液。FORMA3111 CO2恒溫培養箱（美國Thermo Fisher公司）；AIRTECH生物安全柜（產地：中國）；Nikon TE 300倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Osterode離心機（德國Thermo Fisher公司）；酶標儀（美國Thermo公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 將HK-2細胞置于MEM ALPHA培養基中，并加入10%青霉素及鏈霉素100 μg/mL，在 95%O2、5%CO2、37 ℃條件下傳代培養。

2.2 含藥血清的制備 取健康SD雄性大鼠12只，測體質量，根據體質量分層隨機分為空白血清組、糖腎1號方低劑量組、糖腎1號方高劑量組，每組4只，依據人臨床用藥劑量，計算出大鼠的等效劑量，本實驗中糖腎1號低劑量組為等效劑量，高劑量組為等效劑量的5倍，低劑量組用藥劑量18 g/kg，高劑量組用藥劑量90 g/kg，灌胃給藥；空白血清組使用生理鹽水灌胃。灌胃劑量10 mL/kg，1次/日，共7 d。于第7天灌胃后30 min經大鼠股動脈取血10 mL，離心制備血清，56℃滅活，-20℃凍存備用。

2.3 細胞實驗分組 1）空白組：MEM ALPHA培養基；2）高糖組：MEM ALPHA培養基+30 mmol/L葡萄糖；3）空白血清對照組：MEM ALPHA培養基+30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清；4）糖腎1號方低劑量組：MEM ALPHA培養基+30 mmol/L葡萄糖+10%低劑量含藥血清；5）糖腎1號方高劑量組：MEM ALPHA培養基+30 mmol/L葡萄糖+10%高劑量含藥血清。

3 RT-PCR實驗方法

3.1 引物設計 在NCBI基因庫中查詢所需要的相關基因序列，然后通過Primer 5引物設計軟件來設計引物序列，設置好后與blast網站中的基因序列進行對比，最后確定目的基因的序列，具體信息見表1。

表1 引物序列列表Tab.1 List of primer sequences

3.2 實驗方法 用Trizol提取腎HK-2細胞總RNA后，采用TIANScript RT KIT逆轉錄試劑盒進行反轉錄得到所需cDNA,選擇β-actin為內參基因，用熒光定量PCR儀，進行定量PCR擴增，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析，具體實驗步驟及添加試劑按照試劑說明書進行，所設置的反應體系 20 μL，反應條件為：95 ℃、15 min、1 個循環，95 ℃、10 s、40 個循環，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s。

4 Western Blot實驗方法

提取總蛋白后用考馬斯亮藍法測定各細胞樣本蛋白含量。根據蛋白定量的結果，于離心管中加入相應體積的總蛋白樣品和蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液并輕輕混勻，置于95℃加熱片中進行蛋白變性處理10 min，然后迅速插入冰中冷卻待用；將變性后的蛋白樣品輕輕用加樣器小心加至凝膠孔中，設置電泳儀參數為穩壓狀態并接通電源，將電壓調至80 V進行電泳；裁剪好PVDF膜并置于100%甲醇中浸泡2～3 min使其活化，然后用水和電轉液分別漂洗2 min；同時剪裁與膠同樣大小的6層濾紙，并用轉移緩沖液浸泡備用。電泳結束后取下電泳板，小心剝離夾板中的墊片并去掉上層玻璃板，切除濃縮膠部分，用電轉液將含樣品膠漂洗1次；按照從黑色負極開始依次為海綿墊片、3層濾紙、樣品膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿墊片，排列整齊后用玻璃棒輕壓以排除多余的氣泡，固定好放入含有轉膜緩沖液的轉移電泳槽中；設置電流130 mA，電壓20 V左右，轉膜時間為30 min。轉膜結束后，逐層掀去各層，小心取出PVDF膜標記好正反面及樣品順序后放入封閉液中，水平搖床上緩慢震蕩室溫封閉1 h；將一抗用封閉液稀釋；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，置于水平搖床上緩慢振蕩室溫孵育4 h；回收一抗，用TBST洗膜3次，將洗滌后的一抗反應膜以1∶3 000的比例放入二抗工作液中，室溫、避光放搖床上緩慢搖動作用60 min；回收二抗，用1×TBST洗膜3次，用凝膠成像系統曝光及洗片，用Image J軟件分析灰度值。

5 數據分析

實驗數據用軟件SPSS 22.0進行分析處理，以均數±標準差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

6 實驗結果

6.1 RT-PCR檢測HK-2細胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達

6.1.1 TGF-β1 mRNA表達 與空白組相比，高糖組TGF-β1 mRNA表達明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組 TGF-β1 mRNA表達量較多，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號方低劑量組和糖腎1號方高劑量組TGF-β1 mRNA表達量均減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與糖腎1號方低劑量組比較，糖腎1號方高劑量組TGF-β1 mRNA表達減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

6.1.2 α-SMA mRNA表達 與空白組相比，高糖組α-SMA mRNA表達明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組α-SMA mRNA表達增多，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號方低劑量組和糖腎1號方高劑量組α-SMA mRNA表達量均減少，差異具有統計學意義（P<0.05）；與糖腎1號方低劑量組相比，糖腎1號方高劑量組α-SMA mRNA表達量減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

6.1.3 FN mRNA表達 與空白組相比，高糖組FN mRNA 表達增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組FNmRNA表達無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號方低劑量組和糖腎1號方高劑量組FN mRNA表達量均減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與糖腎1號方低劑量組相比，糖腎1號方高劑量組FN mRNA表達減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 RT-PCR檢測檢測腎小管上皮細胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達（相對β-actin的相對表達量，±s）Tab.2 RT-PCR detection of tubular epithelial cells TGF-β1,α-SMA,FN mRNA expression(relative to β-actin relative expression,±s)

表2 RT-PCR檢測檢測腎小管上皮細胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達（相對β-actin的相對表達量，±s）Tab.2 RT-PCR detection of tubular epithelial cells TGF-β1,α-SMA,FN mRNA expression(relative to β-actin relative expression,±s)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05；與糖腎 1 號方低劑量組比較，△P＜0.05。

組別 n TGF-β1 α-SMA FN空白組 3 1.10±0.19 1.00±0.04 1.02±0.04高糖組 3 19.19±2.87* 3.05±0.40* 5.99±0.80*空白血清組 3 17.41±1.03* 2.70±0.39* 5.98±0.54*糖腎 1 號方低劑量組 3 8.69±1.64*# 1.81±0.05*# 3.5±0.68*#糖腎 1 號方高劑量組 3 4.55±0.65*#△ 1.45±0.09# 2.0±0.44#△

6.2 WesternBlot法檢測腎小管上皮細胞中TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達

6.2.1 TGF-β1蛋白表達 與空白組相比，高糖組TGF-β1蛋白表達增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組TGF-β1蛋白表達量減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎1號方低劑量組和糖腎1號方高劑量組TGF-β1蛋白表達量無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與糖腎1號方低劑量組相比，糖腎1號方高劑量組TGF-β1蛋白表達量無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3和圖1。

6.2.2 α-SMA蛋白表達 與空白組相比，高糖組α-SMA蛋白表達明顯增加，差異具有統計學意義（P<0.05）；與高糖組相比，空白血清組α-SMA蛋白表達減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號方低劑量組α-SMA蛋白表達量減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎1號方高劑量組α-SMA蛋白表達量減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與糖腎1號方低劑量組相比較，糖腎1號方高劑量組α-SMA蛋白表達減少，但減少的灰度值無統計學差異（P＞0.05）。見表3和圖1。

6.2.3 FN蛋白表達 與空白組相比，高糖組FN蛋白表達增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組FN蛋白表達減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎1號方低劑量組和糖腎1號方高劑量組FN蛋白表達量減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與糖腎1號方低劑量組比較，糖腎1號方高劑量組FN蛋白表達減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3和圖1。

表3 Western blot法檢測腎小管上皮細胞TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達（相對 β-actin的灰度值，±s）Tab.3 Western blot to detect the expression of TGF-β1,α-SMA and FN in renal tubular epithelial cells(relative to the gray value of β-actin,±s)

表3 Western blot法檢測腎小管上皮細胞TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達（相對 β-actin的灰度值，±s）Tab.3 Western blot to detect the expression of TGF-β1,α-SMA and FN in renal tubular epithelial cells(relative to the gray value of β-actin,±s)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 TGF-β1 α-SMA FN空白組 3 0.28±0.03 0.32±0.14 0.31±0.06高糖組 3 0.58±0.10* 0.49±0.03* 0.63±0.20*空白血清組 3 0.56±0.11* 0.42±0.04 0.54±0.14*糖腎 1 號方低劑量組 3 0.58±0.04* 0.38±0.09 0.43±0.05*#糖腎 1 號方高劑量組 3 0.61±0.05* 0.28±0.07# 0.37±0.03#

圖1 各組TGF-β1、α-SMA、FN蛋白表達的比較Fig.1 Comparison of TGF-β1,α-SMA and FN proteinexpression in treatment groups of each group

7 討論

DN是糖尿病最常見的并發癥之一，早期臨床表現為微量白蛋白尿，病理表現上表現為腎小球肥大、細胞外基質（ECM）增多、腎小球硬化和間質纖維化[7]。本病屬于中醫“關格”、“水腫”、“腎消”、“內消”、“下消”等范疇，中醫學認為其病因主要與先天稟賦不足、后天飲食不節、平素情志失調、房勞過度、六淫邪毒等密切相關，病位主要在肺脾腎三臟。基本病機為本虛標實，早期多為氣陰兩傷，瘀血阻絡，腎失封藏；日久脾腎俱損，陰陽兩虛，夾有瘀血和水濕潴留，泛溢肌膚；病變晚期，腎陽衰憊，水濕泛濫，濁毒內停，上凌心肺。治療上，因病機多為氣陰虧虛，瘀血阻絡，脾腎虧虛，故治以益氣養陰，活血化瘀，健脾益腎。王耀光教授總結多年治療DN的臨床經驗，認為DN的基本病機為本虛標實，虛實夾雜，本虛以脾腎虧虛、氣陰兩虛為主，以血瘀、痰濁、水濕為標，故提出健脾補腎、益氣養陰、活血祛濁法為治療DN的基本原則，自擬“糖腎1號方”。其主要藥物組成為：黃芪、生地、白術、山藥、丹參、鬼箭羽、川芎、石菖蒲、防己等。方中黃芪、生地、白術、山藥益氣養陰，健脾補腎；鬼箭羽、丹參、川芎、石菖蒲、防己破血通經、養血活血、祛風通絡、化濕祛濁、利水消腫，標本兼治，共奏益氣養陰、健脾補腎、活血化濁法。此外，繼承黃文政教授活血通絡、散結通絡思想，認為DN腎纖維化屬于濕濁瘀毒互織之“微型癥瘕”，因此臨床上多配伍蟲蟻搜剔之品以破血逐瘀通絡，祛頑痰、破死血。瘀阻輕者可用蟬蛻、白僵蠶、地龍，稍重者可加用全蝎，瘀阻嚴重者可加用蜈蚣、烏梢蛇等[8]。

DN腎纖維化的發病機制比較復雜，與氧化應激、糖脂代謝紊亂、炎癥反應等有關，還涉及多種信號轉導通路、細胞因子、炎癥介質等。目前干預DN腎纖維化主要從原發病入手，如控制血糖、調節血脂、改善腎臟血流動力學、保護腎功能等，經過前期臨床觀察，發現“糖腎1號方”可以控制血糖、調節血脂、降低24 h尿蛋白定量保護腎功能[5]。TGF-β1是目前公認的致纖維化細胞因子，在腎纖維化中發揮著關鍵作用，可調節腎小管上皮細胞向間充質轉化（EMT）[9]。EMT是腎小管間質纖維化的關鍵環節之一。α-SMA是EMT的主要標記蛋白，是肌成纖維細胞產生的標志[10]。α-SMA表達的增多，說明成纖維細胞被活化，分泌和增殖膠原的能力增強，細胞外基質形成增多，促進纖維化的形成。因此，TGF-β1和α-SMA的表達對于EMT和ECM的進展及預后具有重要意義[11]。FN異常增高提示細胞外基質過度積聚，是糖尿病腎病腎間質纖維化的主要表現之一[12]。因此腎病纖維化的進程可以通過TGF-β1、α-SMA、FN的表達水平來反應。HK-2細胞自身具有非常強的可塑性，為適應不同的生存環境，可針對外來不同刺激作出相應的自身調節反應。高糖培養HK-2細胞24 h時出現細胞形態改變，細胞伸長呈梭形，輪廓界限不清晰。高糖培養短時間刺激其增殖，刺激ECM的分泌，促進表達，長時間刺激誘導HK-2細胞大量凋亡，并可誘導小鼠腎小管上皮向肌成纖維細胞轉分化[13]。本實驗以高糖環境下培養的HK-2細胞為模型，經糖腎1號方含藥血清干預后，TGF-β1、α-SMA、FN mRNA 表達水平明顯被抑制（P＜0.05），相應的 α-SMA、FN 蛋白的表達水平也出現了明顯的下調（P＜0．05），這說明糖腎 1號方抗腎病纖維化的作用機制可能與其能夠影響腎纖維化環路中關鍵基因及蛋白的表達水平有關。在高濃度含藥血清與低濃度含藥血清的比較中發現不同濃度對于TGF-β1和FN mRNA的表達有明顯的差異，且高濃度含藥血清功效明顯優于低濃度含藥血清。說明藥量的不同，其藥物效應也會產生一定的變化。

綜上所述，糖腎一號方可治DN纖維化的作用機制可能為：該方可干預高糖環境下HK-2細胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA 及蛋白表達水平，通過下調TGF-β1、α-SMA及FN mRNA表達，進而下調α-SMA及FN蛋白表達，從而抑制腎間質纖維化過程中關鍵的EMT和ECM過度沉積過程，在一定程度上達到抑制腎間質纖維化過程的目的。故糖腎I號方或可在DN治療中具有一定意義，有助于延緩DN進展至ESRD的進程。