益胃湯對初老雌性大鼠下丘腦作用的差異蛋白分析*

張英杰，王 鵬，張美英，隋凱悅，路 芳

（1.淄博市中西醫結合醫院，淄博 255000；2.山東中醫藥大學，濟南 250014；3.天津中醫藥大學附屬武清中醫院，天津 301700）

20世紀末中國進入老齡化社會，人口老齡化問題成為新的挑戰。隨著經濟的日益發展，人們開始關注衰老方面的研究。衰老過程是復雜的，原因多樣，關于衰老的學說更是各不相同，有自由基學說、線粒體學說、遺傳學說等，其中比較公認的是自由基學說。通過國內外研究發現，中醫藥大多從健脾補腎方向開展抗衰老研究。

近年來，譚萬信教授等[1]根據《素問·上古天真論》中“女子七歲，腎氣盛，齒更發長……五七，陽明脈衰，面始焦，發始墮”的論述，提出補益陽明津氣可以延緩女性衰老，并取得一定的進展。研究提示，益胃養陰生津的代表方益胃湯能夠通過改善中樞神經遞質功能紊亂的狀態，調節神經內分泌功能，進而延緩初老雌鼠生殖軸衰老[2]。益胃湯組成藥物有北沙參、麥門冬、冰糖、細生地、玉竹。本實驗旨在從蛋白質水平探索益胃湯對下丘腦的調節作用，篩選并分析大鼠下丘腦具有顯著差異表達的蛋白，進一步探尋益胃湯延緩衰老的分子機制。

1 材料與儀器

1.1 動物 SD雌性大鼠30只，月齡10～12個月和4～6個月：由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。許可證號：scxk（京）2014-0004。

1.2 藥物及試劑 北沙參、麥門冬、細生地、玉竹、生理鹽水（淄博市中西醫結合醫院）；冰糖（百貨商店）；尿素（Urea）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、IPG buffer、甲酸（FA）（美國 GE 公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羧基氨基甲烷（Tris）、三氯乙酸（TCA）、過硫酸銨（AP）、四甲基乙二胺（TEMED）（美國Amresco公司）；三乙二胺碳酸鹽（TEAB）、考馬斯亮藍G-250（美國Sigma公司）；胰蛋白酶（美國Promega公司）；乙腈（ACN）、水等（美國 Thermo公司）。其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 SciexTripleTOF5600質譜儀（美國SCIEX公司），配有納升噴霧Ⅲ離子源（美國SCIEX公司），Eksigent nanoLC-1D plus液相系統（美國SCIEX公司）以及Analyst TF 1.6數據處理軟件；Eppendorf冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；ImageScanner掃描儀（美國GE Healthcare公司）；真空冷凍干燥機（美國Thermo公司）；超聲波細胞粉碎機VCX130（美國Sonics公司）；電泳儀Mini PROTEAN tetra Cell（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及建模 30只健康雌性大鼠，普通飼料常規喂養。去勢組（4～6月齡）采用10%苯巴比妥，60 mg/kg ip，將大鼠麻醉成功后，切除雙側卵巢。切除卵巢24 h后進行陰道細胞學涂片，每日1次，連續5 d，若陰道角化細胞指數低于50%，則造模成功。同時初老組（10～12月齡）亦作陰道細胞學涂片，方法時間同去勢組相同，若陰道角化細胞指數高于50%，則為初老模型。正常組（10～12月齡）每天作陰道細胞學涂片，每日1次，連續5 d，以陰道角化細胞指數高于50%者為正常模型。

2.2 給藥方法兩組均以益胃湯27 g/（kg·d）進行灌胃，正常組以生理鹽水13.5 mL/（kg·d）進行灌胃，連續灌胃4周。末次灌藥結束24 h后斷頭處死，取大鼠下丘腦組織。

2.3 下丘腦組織處理 采用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術分離、分析、鑒定大鼠下丘腦差異蛋白：1）蛋白提取和定量，本樣品濃度測定采用BCA蛋白濃度測定方法[3]；2）胰蛋白酶酶解及標記；3）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3 結果

3.1 蛋白濃度測定結果 測定方法為聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白濃度測定方法，結果見表1。

表1 下丘腦蛋白樣品吸光度及濃度Tab.1 Absorbance and concentration of hypothalamus protein sample

3.2 SDS-PAGE結果 用ImageScanner掃描儀掃描染色后的凝膠，SDS-PAGE測定結果見圖1。

3.3 可信蛋白及差異蛋白篩選結果 酶解標記后的下丘腦蛋白樣品利用液質聯用技術進行分析，分析后進行數據庫檢索。對得到的檢索結果按照Unused＞1.3且peptide≥1，并去除空白值和反庫數據的標準篩選可信蛋白，篩選結果為：可信蛋白3 706個。計算得到每一比較組的差異倍數Fold Change（FC）值和差異顯著性 P 值，以 FC＞1.5或FC＜2/3且P＜0.05為標準篩選差異顯著蛋白，篩選結果初老組差異蛋白96個，去勢組差異蛋白95個。圖2和圖3分別為初老組和去勢組下丘腦差異蛋白火山圖。對初老組和去勢組的差異蛋白取并集得到動態變化蛋白173個。通過檢索Uniprot數據庫，篩選出與衰老相關的蛋白共7個。其中，顯著上調者：纖溶酶原（plasminogen）、α-晶體蛋白 B 鏈（αcrystallin B Chain）、 血 清 轉 鐵 蛋 白（serum transferrin）、非常規肌球蛋白-Id（wnconventional myosin Id）、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白、蛋白質Fbxo4（4 Grotein Fbxo44）；顯著下調者：Hsp70 結合蛋白 1（Hsp Toblinding protein 1）。

圖1 下丘蛋白樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of hypothalamus protein sample

圖2 初老組火山圖Fig.2 Volcano plot of precocious group

圖3 去勢組火山圖Fig.3 Volcano plot of castrated group

3.4 KEGG通路檢索結果 通過檢索KEGG Pathway Maps數據庫，發現神經活性配體-受體相互作用、補體和凝血級聯、長壽調節途徑（多種）、HIF-1信號通路、磷酸酶活性的負調控通路、細胞黏附、適應性免疫系統、抗原處理、泛素化和蛋白酶體降解、I類MHC介導的抗原加工和呈遞、免疫系統等通路與衰老有直接或間接的聯系。

4 討論

通過對正常組、初老組和去勢組下丘腦蛋白質平均含量的綜合比較，最終確定在對初老雌鼠生殖機能衰老的影響上，共有7種具有顯著差異的蛋白質，它們分別為plasminogen、α-crystallin B chain、Hsp70 binding protein 1、serum transferrin、unconventional myosin-Id、myelin oligodendrocyte glycoprotein、protein Fbxo44。通過FC值比較發現，其中除了Hsp70 binding protein 1之外的其他蛋白，在初老組中表達較去勢組更顯著，表明益胃湯對初老組干預作用較去勢組明顯。這些差異蛋白主要涉及免疫系統、細胞凋亡、炎癥反應、腫瘤發生、蛋白的轉運和催化、蛋白的代謝等過程，這些過程與衰老存在直接或間接的聯系。

4.1 上調的差異蛋白基因（GO）分析和KEGG通路的討論分析

4.1.1 纖溶酶原 纖溶酶原參與腫瘤侵襲和炎癥反應，纖溶酶原對應基因為Plg，參與的KEGG通路有神經活性配體-受體相互作用，補體和凝血級聯。盧根林等[4]通過臨床研究發現，急性胰腺炎（AP）患者血漿Plg活性減低明顯。Liu等[5]通過實驗研究發現，在魚藤酮誘導的帕金森病（PD）模型中，Plg可以通過恢復凋亡和自噬之間的平衡對PD起到治療作用。Per Svenningsen等[6]研究發現，一些具有腎表達的纖溶酶原被表面受體激活后，可以通過在腎中表達的蛋白酶活化受體PAR發揮作用，并且對腎臟疾病的組織重塑和炎癥有一定的意義。本實驗研究發現，益胃湯對Plg在蛋白酶激活過程中的作用是上調的。筆者認為，Plg表達的提高，可能會增加細胞表面蛋白酶活化受體PAR的數量，誘發凝血反應、促進細胞釋放炎癥介質或細胞因子，對局部炎癥反應或細胞凋亡進行調控，這可能是益胃湯延緩初老雌鼠生殖機能衰老的作用機制之一。

4.1.2 α-晶體蛋白B鏈 α-晶體蛋白B鏈對應基因為Cryab，參與老化、凋亡過程涉及形態發生，活性氧代謝過程負調節。細胞衰老與纖維化、炎癥以及癌癥等多種疾病有著密切的關系[7]。α-晶體蛋白B鏈[8]廣泛存在于多種細胞中，屬于小分子熱休克蛋白家族，因此其亦具有熱休克蛋白家族的基本功能。α-晶體蛋白B鏈參與抗細胞凋亡過程，研究者發現，其能抑制由細胞抵抗高溫、射線，缺氧，藥物等多種因素引起的細胞凋亡[9]。慢性炎癥是衰老進程中主要的病理表現，唐蜜[10]研究發現多巴胺受體D2可通過調節Cryab發揮抑制神經炎癥的作用。通過本實驗和KEGG通路查閱發現，在益胃湯的作用下，Cryab的表達是上調的，筆者認為益胃湯可能具有抗細胞凋亡的作用，同時亦具有多巴胺受體D2類似的作用，可以通過調節Cryab表達干預炎癥反應，延緩衰老。

4.1.3 血清轉鐵蛋白 血清轉鐵蛋白對應基因為Tf，參與急性期反應、鐵凋亡、細胞凋亡、少突膠質細胞祖細胞增殖的正調控，參與ephrin-ephrin受體雙向信號軸，參與的KEGG通路為HIF-1信號通路。HIF-1是一種轉錄因子，其作為氧穩態的主要調節劑起作用。王銀芳[11]在研究中指出，低氧可以誘導自噬，而且主要是通過HIF-1α/BNIP3信號通路實現的，同時低氧自噬與細胞的凋亡、侵襲性以及腫瘤的發生等具有重要關系。袁玉梅[12]研究發現修復衰老大鼠海馬神經元完整自噬流可以抵抗應激損傷，延緩衰老的進程。同時，Tf可以促進機體內鐵凋亡，減少鐵蓄積，增加抗氧化應激酶活性，緩解氧化應激[13]。而從本實驗益胃湯對基因表達的結果來看，Tf在HIF-1信號通路中是上調表達，進而筆者認為益胃湯延緩初老雌性大鼠衰老的機制之一，可能是通過增加機體內氧的運輸量，從而降低低氧自噬的發生，減少了細胞凋亡。

4.1.4 非常規肌球蛋白-Id 非常規肌球蛋白-Id對應基因為Myo1d，涉及前腦發育，細胞定位，參與磷酸酶活性的負調控通路。鎬振選[14]在研究中指出，多個和衰老相關的基因已經被證實和血管功能障礙有關，其中存在于樹突及神經元胞體中的基因KNDC1，具有蛋白磷酸酶活性，而既往研究證明KNDC1mRNA轉錄及KNDC1蛋白表達在衰老的HUVECs中有所增加，同時發現敲低KNDC1的表達后，內皮細胞的衰老亦得到延緩。筆者認為益胃湯可能作用于磷酸酶活性的負調控通路，通過干預非常規肌球蛋白-Id表達對具有磷酸酶活性的KNDC1進行抑制，從而延緩大鼠血管內皮細胞衰老。邢方凱[15]在研究中指出，非常規肌球蛋白在調節神經系統突觸可塑性中起重要作用，而突觸是防治與腦老化相關的神經退行性疾病的靶點[16]，因此筆者認為非常規肌球蛋白-Id的顯著表達有利于延緩神經系統衰老，亦可能是延緩初老雌鼠衰老的機制之一。

4.1.5 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白對應基因為Mog，參與老化與細胞黏附。近年來，研究發現髓鞘少突膠質細胞糖蛋白與中樞神經系統炎性疾病相關，神經炎癥是一種免疫應答反應，可以活化神經細胞促使其釋放炎癥介質，并形成毒性循環，致使神經退行性改變，導致神經細胞萎縮，細胞間突觸聯系和蘊藏的生化物質減少，機體接受和傳遞信息的能力降低，出現感覺遲鈍，反應緩慢，記憶力下降，思維阻滯，腦功能降低的現象，這就是所謂的“腦老化”[17]。孫夢雅等[18]也表示，抑制Mog基因及蛋白表達可能是宮內炎癥致新生大鼠腦組織損害的機制之一。因此筆者認為，該基因的下調可能是導致神經炎癥和“腦老化”的因素之一，而益胃湯很可能是通過上調該基因表達，阻止或延緩神經炎癥和“腦老化”的發生，從而延緩初老雌鼠生殖軸的衰老。

4.1.6 蛋白質Fbxo44 蛋白質Fbxo44對應基因為Fbxo44，與泛素-蛋白轉移酶活性的蛋白質的編碼有關，參與蛋白酶體蛋白分解代謝過程，參與的KEGG通路有適應性免疫系統、抗原處理、泛素化和蛋白酶體降解、I類MHC介導的抗原加工和呈遞、免疫系統。高歌[19]通過研究發現Fbxo44在乳腺癌中具有高表達傾向，并推測可能有助于乳腺癌的發展。Benita Sj?gren[20]通過免疫沉淀發現Fbxo44可以通過Cullin 4B/DDB1復合體CUL4B/DDB1/FBXO44 E3連接酶介導RGS2的降解，而RGS2與多種惡性腫瘤的發生、發展有關。研究發現，癌基因的活化可以誘導細胞衰老，稱為癌基因誘導的細胞衰老[21]。因此筆者認為益胃湯可能通過干預Fbxo44的表達，在一定程度上抑制了癌基因的活化和惡性腫瘤的發生，影響了細胞衰老進程，從而間接地延緩了初老雌鼠的衰老。

4.2 下調的差異蛋白基因（GO）分析和KEGG通路的討論分析 Hsp70結合蛋白1對應基因為Hspbp1，參與的KEGG通路為內質網蛋白質加工。宋硯坤等[22]通過研究發現Hsp70可以與抗凋亡基因Bcl-2結合調控細胞凋亡、增殖和信號傳導。褚曉蕾等[23]通過動物實驗研究發現并推測，HSP70與Apaf-1結合量的增強可能是抑制骨骼肌細胞凋亡的機制之一。在生物的應激細胞中Hsp70結合蛋白常處于高度誘導狀態，以保護機體和細胞。在本實驗研究中發現Hspbp1在參與內質網相關性降解過程中是下調表達，益胃湯可能是通過抑制內質網相關性降解過程中Hspbp1的表達，避免內質網功能紊亂的發生，若內質網功能持續紊亂，細胞將啟動caspase12依賴的細胞凋亡程序，這些反應被統稱為未折疊蛋白質應答（UPR）[24]。Hspbp1的表達下調很可能可以抑制細胞啟動凋亡程序，避免細胞死亡，這可能是益胃湯延緩初老雌鼠衰老的機制之一。

5 小結

縱觀整個課題，蛋白質組學技術和動物模型的建立是關鍵部分。在初老模型動物選擇方面，根據前人經驗，考慮到益胃湯干預衰老的時間點應該在“五七”之前，即“未老先防”，因此本課題選擇生殖生理內環境接近女性“五七”之年的10～12月齡SD雌鼠進行研究。結果表明，益胃湯延緩初老雌鼠生殖機能衰老的可能機制有：抗炎癥反應、抑制細胞凋亡、減少腫瘤的發生，該結論亦為本課題后續的深入研究奠定了基礎。