旋覆代赭湯對膽堿能抗炎通路相關RE大鼠炎癥因子的影響*

黃 棪，徐明英，夏雪皎，張俊杰

（浙江中醫藥大學，杭州 310053）

機體受到感染或損傷時，通過調節體內促炎因子和抑炎因子的水平，可以促進外來病原體的清除和組織修復。反流性食管炎（RE）是機體促炎因子和抑炎因子調控失衡引起的一種以食管黏膜損害為表現的炎癥。研究發現，炎癥反應除了通過促腎上腺皮質激素-糖皮質激素軸調節以外，迷走神經介導的膽堿能抗炎通路（CAP）對機體局部和全身炎癥反應也具有調控作用[1]，本研究通過用“頸左側迷走神經切斷術”聯合“賁門肌切開術加部分幽門結扎”制備膽堿能抗炎通路相關大鼠反流性食管炎動物模型[2-3]，觀察食管組織和血漿中促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6 和 IL-10 的含量，探討旋覆代赭湯對反流性食管炎大鼠炎癥因子的調節作用。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD大鼠65只，雄性，體質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物 旋覆代赭湯方：旋覆花、半夏、炙甘草、大棗、代赭石、生姜、人參。藥物購自浙江中醫藥大學中醫門診部，由浙江省中藥研究所制劑室制備。藥物濃縮至含2 g/mL生藥的溶液，高溫消毒滅菌，4℃保存，使用前混勻。

枸櫞酸莫沙比利分散片（產品批號：160411），購自成都康弘藥業集團股份有限公司。配制為濃度0.3 mg/mL的混懸液，4℃保存，使用前混勻。

1.3 試劑 TNF-α（批號：E2016110306）、IL-1β（批號：E2016122104）、IL-6（批號：E2016110304）、IL-10（批號：E2016110305），酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）檢測試劑盒均為杭州誠維生物有限公司產品。

1.4 儀器 脫水機、包埋機、切片機（Micrrom公司產品）；連續光譜酶標儀（美國Thermo公司產品）；顯微鏡（日本Olympus公司產品）。

2 方法

2.1 造模方法 造模前禁食不禁水24 h，行“部分賁門肌切開+外置幽門結扎術”，建立慢性酸性反流性食管炎模型；行“頸部單側迷走神經切斷術”建立膽堿能抗炎通路反流性食管炎模型。

2.2 分組及給藥 隨機分為6組，即正常組、RE組、假手術組、模型組、中藥組和西藥組。除模型組15只外，其余每組10只。RE組為慢性酸性反流性食管炎模型；假手術組在RE組的基礎上，僅分離頸左側迷走神經而不離斷；而模型組、中藥組、西藥組則在RE組的基礎上，單側迷走神經切斷以建立膽堿能抗炎通路RE模型。造模3周后，模型組隨機取5只大鼠食管做病理檢測，驗證模型成功與否；同時開始給藥，各組大鼠相應給予旋覆代赭湯水煎劑、莫沙必利混懸液、生理鹽水。每次按5 mL/kg體質量進行灌胃，每日1次，連續14 d。中藥組給予旋覆代赭湯水煎劑，西藥組給予莫沙必利混懸液，其余各組均給予生理鹽水。

2.3 取材及指標檢測 大鼠末次給藥后，禁食24 h，自由飲水，以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，心臟采血，每只抽取5 mL血液，離心后取上清，置入-20℃冰箱中備用。采血后迅速開腹，取食管-胃交界處向咽喉部截取1.5～2.0 cm長的食管，以0.9%NaCl溶液清洗，用手術剪剖開，肉眼觀察食管黏膜狀況。將食管放入10%福爾馬林中固定，常規病理切片，HE染色，光鏡觀察。按試劑盒說明用酶聯免疫吸附試驗法檢測食管組織和血漿中TNF-α，IL-1β和IL-10含量。

2.4 統計學分析 應用SPSS20.0統計軟件對數據進行處理和分析，結果以均數±標準差（x±s）表示。數值資料進行正態性分布分析，方差齊性檢驗，符合正態分布并且方差齊，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況和體征 正常組大鼠被毛緊密，色白光澤，活動自如，反應敏捷，食欲良好，體質量增長正常，大便呈顆粒狀；造模后的大鼠被毛色黃稀疏，光澤減弱，精神萎靡，食量及體質量下降，大便稀溏。術后1周大鼠體質量緩慢增長，模型組體質量增長較其他組緩慢。實驗中大鼠共死亡6只，假手術組、RE組、中藥組各死亡1只，模型組死亡3只，死亡原因主要有腹腔感染、消化道出血、反流窒息等。治療后中藥組和西藥組大鼠毛色、食欲、體質量等均較模型組改善。

3.2 各組大鼠食管黏膜肉眼及病理表現

3.2.1 食管黏膜肉眼表現 3周時模型組大鼠胃底擴張明顯，胃體積較正常組增加約1倍，食管下端黏膜可見點狀發紅。5周后，模型組大鼠食管黏膜部分可見發白、粗糙，或見點片狀充血，可見點狀黏膜缺損；正常組和治療組表現基本相同，黏膜呈淡紅色，光滑，輕微水腫、充血。假手術組和RE組食管黏膜有不同程度的黏膜發紅、粗糙，程度與模型組相似。

3.2.2 食管黏膜光鏡下病理表現 見圖1。

圖1 食管黏膜光鏡下病理表現

3周時模型組大鼠食管黏膜光鏡下可見鱗狀上皮增生，角質層呈火焰狀增生，固有層乳頭伸長明顯，并有點狀糜爛、炎癥細胞浸潤，提示造模成功。5周后，模型組大鼠黏膜表現較3周組加重，除見鱗狀上皮增生、固有層乳頭伸長，炎細胞浸潤、毛細血管擴張以外，部分大鼠局部還出現潰瘍。而治療組黏膜鏡下表現明顯改善，表現為鱗狀上皮少量增生，固有層乳頭長度縮短，部分大鼠黏膜仍可見糜爛灶。

3.3 各組大鼠食管組織和血漿中炎癥因子含量 與正常組比較，模型組食管組織和血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著性升高（P＜0.01），IL-10差異無統計學意義（P＞0.05）。

與模型組比較，中藥組食管組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量以及血漿中IL-6含量均顯著降低（P＜0.05），西藥組食管組織中 IL-1β、TNF-α 含量及血漿中IL-6含量也降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，中藥組和西藥組IL-10水平，均差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1～2。

表1 各組大鼠食管組織中炎癥因子含量（±s）pg/mL

表1 各組大鼠食管組織中炎癥因子含量（±s）pg/mL

注：與正常組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較 #P ＜0.05，##P＜0.01。

組別 n TNF-α IL-1β IL-10 IL-6正常組 10 278.76±16.94 16.30±1.37 22.87±2.67 119.68±8.53假手術組 9 306.39±17.94**##15.97±2.30## 22.56±2.70 129.59±7.41*##RE 組 9 295.46±19.68## 19.26±1.89*## 23.70±3.78 130.85±4.44*##模型組 7 347.50±17.80** 25.41±1.86** 24.01±4.07 149.83±8.27**中藥組 9 320.82±13.21**#22.27±2.18**#23.55±2.14 139.52±5.62**#西藥組 10 323.66±22.67**#20.38±3.08**##24.28±2.49 143.75±11.87**

表2 各組大鼠血漿中炎癥因子含量（±s）pg/mL

表2 各組大鼠血漿中炎癥因子含量（±s）pg/mL

注：與正常組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較 #P ＜0.05，##P＜0.01。

組別 n TNF-α IL-1β IL-10 IL-6正常組 10 290.97±13.19 18.75±1.73 24.28±3.65 130.67± 6.25假手術組 9 310.71±17.40 22.59±1.62*##22.19±2.64 139.71± 8.48##RE 組 9 305.13±19.68# 22.35±2.64*##24.47±2.72 144.88±13.75*##模型組 7 326.97±21.41**28.68±2.86** 24.27±4.85 168.57±15.06**中藥組 9 319.75±13.94* 26.27±1.56** 23.14±3.41 151.11±12.21**#西藥組 10 317.25±15.12* 26.56±3.21** 22.61±3.06 151.85±11.98**#

3 討論

RE是常見的慢性消化道疾病，該病的發病率在西方國家高達7%～15%，而亞洲地區發病率相對較低，但近年來隨著中國生活方式西化、人口的老齡化，RE的發病率也有增高趨勢[4]。現代醫學對RE的治療目前局限于抑酸藥和促胃腸動力藥，仍有一大部分患者癥狀改善不明顯，旋覆代赭湯在臨床上治療證屬胃虛痰阻，氣逆不降型的反流性食管炎有著顯著的療效，但機制不清楚。

反流性食管炎的發展與炎癥介質密切相關，研究表明，炎癥介質與食管動力、纖維化、惡變程度等相關[5]。在RE患者和動物模型中，IL-1β、TNF-α等炎癥因子較對照組均顯著提高，對IL-10的報道不一致[6-7]。膽堿能抗炎通路（CAP）是一條迷走神經介導的神經免疫抗炎通路，刺激迷走神經，可以激活CAP，抑制多種促炎因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α 等的合成和釋放，改善全身或局部炎癥，但CAP的激活對IL-10水平不影響[8]。臨床上，對于食管賁門癌患者，腫瘤未侵及周圍組織的患者，術中采取保留迷走神經的術式，可以明顯降低術后反流性食管炎的發生率[9-10]。在急性反流性食管炎模型中，切斷雙側迷走神經，可以使食管黏膜損傷加重，電刺激切斷的迷走神經后，可以激活CAP，減輕食管損傷。目前研究表明，在類風濕關節炎[11]、結腸炎[12]、胰腺炎[13]等動物模型中，切斷頸部單側迷走神經可以阻斷迷走神經的保護作用，加重模型局部癥狀。

本實驗中，與正常組比較，RE組血漿和組織中IL-1β、IL-6含量及模型組血漿和組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均是升高的，且模型組的血漿和組織中 TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于 RE 組；但各組之間比較，對IL-10沒有統計學差異。說明反流性食管炎發生時，主要是通過膽堿能抗炎通路，使促炎因子增加引起的機體調節失衡，單側迷走神經阻斷，可以加重反流性食管炎的炎癥反應。與模型組比較，中藥治療組食管組織中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子水平顯著降低，但對抑炎因子IL-10無影響。說明旋覆代赭湯可能是通過抑制促炎因子的釋放來發揮抗炎作用的。