羥基紅花黃色素對博萊霉素致間質性肺病小鼠的作用機制研究*

王 英 ，孫宇鵬 ，張 偉

（1.山東中醫藥大學，濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250011）

間質性肺病（ILD），又稱彌漫性實質性肺病（DPLD），是一組以肺泡壁炎細胞浸潤和纖維化改變為基本病理表現的肺部疾病的總稱。其中特發性肺間質纖維化（IPF）是一種病因仍不明確，并且病情進行性加重，主要病理表現為纖維化伴蜂窩狀改變，占特發性間質性肺炎（IIP）的 60%-70%[1]，IPF 治療指南中強不推薦糖皮質激素等治療，尼達尼布和吡非尼酮被推薦用于IPF的治療[2]，其發病率逐年增加，5 a生存率低導致、治療藥物局限導致IPF成為臨床治療難題。針對以上臨床治療間質性肺病的現狀及觀察近年來中醫中藥治療本病的進展，結合活血化瘀類中藥治療間質性肺病的臨床研究，選取紅花單味藥治療間質性肺病，并進行對比研究，通過氣管內博萊霉素（BLM）建立間質性肺病小鼠模型，分析中藥紅花的提取物紅花黃色素對間質性肺病的作用機制，力爭進一步研究活血化瘀類藥物紅花在治療間質性肺中的作用機制，為中藥治療本病提供新的思路。

1 材料

注射用紅花黃色素注射液（購自山東中醫藥大學附屬醫院）；BLM（購自合肥博美生物科技有限責任公司，貨號：LB3051）；低分子量肝素鈉注射液，購自齊魯制藥有限公司，貨號：H20030429；TRNzol總RNA提取試劑，購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP405-02；ROX plus，購自 TaKaRa，貨號：RR82LR；小鼠白介素（IL）-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，產品編號：EK0411。TGF-β1 ELISA檢測試劑盒，購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，貨號：KGEHC107b-1；CTGFELISA 檢測試劑盒，購自上海超研生物科技有限公司，貨號：SEA010HU。

2 方法

2.1 動物 KM小鼠90只（山東省實驗動物中心提供，動物生產許可證號SYXK（魯）201400007號），鼠齡為8周齡，體質量為18～22 g。隨機分為對照組、模型組及紅花黃色素組3組，每組為30只。模型組和紅花黃色素組予BLM誘導小鼠肺纖維化，建立雄性間質性肺病小鼠模型，對照組以生理鹽水代替；實驗開始后第21天，隨機取3只小鼠解剖，第28天解剖全部小鼠，取肺組織，結束實驗，其中第21天、第28天取右下肺分別做病理切片；第28天取左下肺葉用ELISA法測定TGF-β1、IL-6；第28天取右中上肺葉應用實時定量熒光PCR（RTPCR）法檢測血管內皮生長因子（VEGF）和內皮細胞型纖溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）的表達。

2.2 組織處理 處死小鼠后取出肺組織于10%中性甲醛中固定，經脫水、包埋制成蠟塊并制作病理切片，Masson染色觀察。

2.3 ELISA法檢測各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6含量 取小鼠完整左下肺臟，用預冷的生理鹽水清肺臟，無菌紗布擦拭，稱質量，在冰盤上剪碎，按照每克肺組織加10 mL生理鹽水，在冰浴條件下用組織勻漿機以15 000 r/min的轉速研磨，制成肺勻漿，離心后取上層清液，采用ELISA法測定IL-6以及TGF-β1的含量。

2.4 Real Time PCR方法檢測VEGF和PAI-1 mRNA的表達 取小鼠完整右上、中肺葉，用生理鹽水沖去肺臟表面的組織和血污，儲存于-80℃冷凍柜中，提取RNA，進行逆轉錄，應用RT-PCR方法檢測VEGF和PAI-1的表達。實驗操作嚴格按產品說明書進行。

表1 引物序列及PCR產物大小

2.5 統計分析 使用SPSS 24.0軟件進行數據處理，連續變量用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett’s T3法。P＜0.05說明差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠肺組織病理學改變 空白組肺內結構清晰正常，未見炎性浸潤，無充血以及纖維組織增生，肺泡腔內無明顯滲出。模型組肺泡結構破壞、融合嚴重，肺泡腔內存在大量炎性浸潤，纖維組織增生明顯，后期較前期損壞明顯。紅花黃色素組間質毛細血管充血、水腫，存在炎性細胞浸潤，部分肺泡肺泡融合、閉陷，纖維組織輕度增生。

圖1 光鏡下經Masson染色肺組織病理表現

3.2 ELISA法檢測各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6含量 與空白組比較，模型組小鼠肺組織TGF-β1、IL-6含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，注射用紅花黃色素組小鼠肺組織TGF-β1含量明顯降低（P＜0.01），IL-6 含量降低（P＜0.05），見表 2。

表2 各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6表達含量（s，n=30）pg/mL

表2 各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6表達含量（s，n=30）pg/mL

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n TGF-β1 IL-6的濃度模型組 30 125.79±20.98** 74.61±11.96**紅花黃色素組 30 91.13±21.28## 64.41±10.03#對照組 30 73.27±22.02 49.97±10.76

3.3 RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織中PAI-1、VEGFmRNA的表達水平 與空白組比較，模型組小鼠肺組織PAI-1、VEGF mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，注射用紅花黃色素組小鼠肺組織VEGF表達水平明顯降低（P＜0.01），PAI-1表達水平無差異，見表3。

表3 各組小鼠肺組織中PAI-1、VEGF mRNA的表達水平（±s，n=30）注：與對照組比較：*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

4 討論

近些年來臨床觀察及研究表明中醫藥治療本病存在優勢，獲效顯著，但治療機制的實驗研究仍不全面。活血化瘀藥，性味以辛、苦、溫為主，辛能散、行，苦則通泄，且入血分，所以活血化瘀藥可行血活血，通暢脈絡，消瘀散滯。紅花是一味傳統的活血祛瘀中藥，本文通過實驗研究，應用中藥紅花的提取物紅花黃色素治療博萊霉素所致間質性肺病小鼠，從相關基因表達及細胞因子等角度進行分析，檢測 TGF-β1、IL-6、PAI-1、VEGF 等各項指標[3-6]。

本實驗研究中，與空白組比較，模型組小鼠肺組織 TGF-β1、IL-6、PAI-1、VEGF mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅花黃色素組小鼠肺組織 TGF-β1含量明顯降低（P＜0.01），IL-6含量降低（P＜0.05），紅花黃色素組小鼠肺組織VEGF表達水平明顯降低（P＜0.01），PAI-1表達水平無差異，紅花黃色素治療組小鼠各項指標總體優于模型組小鼠，具有統計學意義（P＜0.05），提示中藥紅花的提取物紅花黃色素可以在治療間質性肺病中通過多途徑延緩病情發展。本實驗為進一步研究紅花治療間質性肺病提供理論基礎。