清肝通絡飲對SHR的降壓及心臟保護作用的研究*

沙爭梅，徐宗佩，李菁浩，王宏波，李 琳，劉 虹，李琳瑋，楊鵬飛，李玉紅

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193）

原發性高血壓（EH）是以血壓升高為主要臨床表現，嚴重影響人類健康的常見慢性病。目前中國高血壓患者總數達到4.5億，高血壓患病率增至66%[1]，原發性高血壓發病率占高血壓總發病率的90%[2]，心血管導致居民死亡率達40%，高于腫瘤及其他疾病[3]。血壓的升高，提示機體某些部位存在缺血情況，對于這種情況，中醫歸于絡脈不暢，絡脈不得滋榮，氣血隨火上逆，血壓升高[4]。患者多由于肝火、肝陽亢盛而導致頭痛、眩暈、頭脹、眼睛干澀不適、脈弦等臨床表現，采用清肝火、平肝陽、通絡活血等方法予以治療。徐宗佩教授根據多年臨床治療高血壓的經驗與體會，在對病機充分認識的基礎上，化裁天麻鉤藤飲等名方而擬清肝通絡飲方[4]。前期臨床觀察表明[5],清肝通絡飲可以有效減低患者血壓，并緩解頭痛、頭脹等癥狀，同時還有降低血脂的功能。本實驗以自發性高血壓大鼠（SHR）為模型[6]，采用大鼠尾動脈無創傷性測壓儀測定清醒狀態下SHR的尾動脈血壓，觀察清肝通絡飲對SHR血壓的影響；并觀察了其對大鼠心臟功能和形態、血脂的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SHR，40只，SPF級，雄性，10周齡，體質量（220～250）g；魏一凱二氏大鼠（WKY），8只，SPF 級，雄性，10 周齡，體質量 200～220 g，均由北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0011，動物合格證號：11400700213562。飼養于天津市中國醫學科學院放射醫學研究所清潔級動物房，室內溫度為（20～25）℃，相對濕度（40～60）%，自由飲食及飲水。

1.2 實驗藥物

1.2.1 清肝通絡飲及其制備 清肝通絡飲組成：鉤藤20 g（飲片批號160901）、野菊花 15 g（飲片批號160801）、夏枯草 15 g（飲片批號 161001）、決明子20 g（飲片批號 1508627191）、牛膝 30 g（飲片批號161201）、地龍 20 g（飲片批號 160901）、土鱉蟲 10 g（飲片批號161201）、黃芩12 g（飲片批號161201）、炒梔子12 g（飲片批號151101）、丹參30 g（飲片批號 161201）、益母草 20 g（飲片批號 160901）、杜仲12 g（飲片批號161001）、桑枝30 g（飲片批號160901）、威靈仙 15 g（飲片批號 161201）、茯苓 15 g（飲片批號161202）。中藥飲片均購于河北安國祁安藥業有限公司，經天津中醫藥大學副研究員劉虹鑒定均為藥典規定品種。將中藥飲片稱質量后，用10倍量的水浸泡0.5 h，回流提取第1次，用8倍量的水回流提取第2次，每次1.5 h，兩次液體合并為清肝通絡飲原液，經旋轉、蒸發、烘干、稱質量，計算出膏率（出膏率=干膏率/藥材量×100%）如表1，并將所得干膏研細，密封置于干燥器內備用。

表1 藥品提取率

陽性對照藥為纈沙坦膠囊（代文），規格：80 mg×7片/盒。藥品購于北京諾華制藥有限公司，產品批號：X2062。

1.2.2 藥物的配制及給藥 清肝通絡飲高、中、低劑量組 25g、12.5g、6.25g生藥/kg，將成人每日用量 276g按體表面積折算成大鼠等效劑量的1倍、0.5倍、0.25倍分別是[25 g、12.5 g、6.25 g生藥（/kg·d）]。3個劑量分別制備成不同濃度，等體積浸膏灌胃大鼠。參考相關文獻[7-8]，陽性對照組纈沙坦用藥量為（15 mg/kg），相當于將成人每日用量按體表面積折算成大鼠等效劑量的2倍。給藥組大鼠均按100 g體質量給予1.0 mL藥物的體積每日灌胃1次，空白組、模型組均以灌胃的方式給予等體積的純水。連續給藥10周至實驗結束。所有藥液，超聲溶解后，4℃冰箱儲存備用，灌胃前搖均。

1.3 實驗儀器 大小鼠智能無創血壓計（北京軟隆生物技術有限公司）；小動物超聲儀（加拿大Visual Sonics公司）；全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；-80℃低溫冰箱（日本Sanyo公司）；萬分之一天平（德國Sartorius公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 8只WKY大鼠，4只/籠，為對照組；40只SHR，根據血壓測量結果，隨機分為5組，每組8只，分別為：模型組、纈沙坦組、清肝通絡飲高劑量[25 g生藥/（kg·d）]組、清肝通絡飲（中劑量組）[12.5 g生藥/（kg·d）]組、清肝通絡飲（低劑量組）[6.25 g生藥/（kg·d）]組。

2.2 大鼠血壓的測量 大鼠適應性飼養1周，運用大小鼠智能無創血壓計給予大鼠每天進行血壓測量訓練，連續訓練7 d，同時觀察大鼠的活動、進食和皮毛狀況。在大鼠清醒狀態下，分別給藥前、藥后每周測量收縮壓（SBP）。測量過程完全嚴格按血壓計操作手冊規范進行操作，在安靜、溫暖的環境中，首先將測量裝置連接好并開啟保溫裝置，將大鼠置于保溫筒內固定，動作要輕柔，使大鼠盡量保持安靜，預熱（37～38.5）℃約15 min，待大鼠情緒穩定后，將加壓感應器置于其尾根處，待尾部脈搏波形穩定時，血壓計自動加壓測量，共測量5次，每次分別讀取并記錄SBP值，取平均值。每次在相同的環境下進行血壓測量，以確保實驗結果的穩定性。

2.3 超聲心動檢測大鼠心臟功能和形態 末次給藥后，進行小動物心動超聲檢測。將動物用10%水合氯醛ip（300 mg/kg），麻醉后，胸前區脫毛，將大鼠腹部向上，固定于操作臺，胸部區域涂抹一層耦合劑，選用高頻矩陣探頭，探頭垂直于左胸壁，與胸骨約成10～30°夾角，通過X、Y微調操作臺位置，將探頭轉動，在胸骨旁長軸，可見左心室主動脈和二尖瓣瓣葉，顯示心臟沿二尖瓣口至心尖方向的左室長軸像。在左室長軸像引導下，左室內徑最大處顯示M型圖像。選用長軸測量包對大鼠收縮期和舒張期的心功能及形態學指標。心臟功能指標：左室射血分數（EF）和左室短軸縮短率（FS）。心臟形態學指標：左室舒張末期內徑（Lvid.d）、左室收縮末期內徑（Lvid.s）、舒張末期室間隔厚度（Ivsd）、收縮末期室間隔厚度（Ivss）、舒張末期左室后壁厚度（Lvpw.d）、收縮末期左室后壁厚度（Lvpw.s）、左心室質量（Mass）、左心室舒張末期容積（Vol.d）、左心室收縮末期容積（Vol.s）。每只大鼠均取3個心動周期進行測量，取平均值。

2.4 標本的采集 超聲心動圖檢測后，對大鼠進行腹主動脈取血，取血后于管口標記，置于37℃水浴 30 min，3 000 r/min，離心 15 min，取血清分裝放于-80℃冰箱保存備用。

2.5 生化指標的檢測 應用全自動生化分析儀，檢測各組大鼠血清中血脂（TC、TG、HDL、LDL）含量。

2.6 統計學處理 用SPSS17.0軟件進行數據統計，各組實驗數據計量資料應用均數±標準差（x±s）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析。組間兩兩比較，若方差齊用LSD，若方差不齊采用Dunnett’s T3，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

表2 清肝通絡飲單次給藥對SHR的SBP的影響（x±s）mmHg

表3 清肝通絡飲連續給藥10周對SHR大鼠SBP的影響（x±s）mmHg

3 實驗結果

3.1 清肝通絡飲對SHR大鼠血壓的影響

3.1.1 單次給藥對SHR血壓的影響 結果顯示，模型組大鼠收縮壓顯著升高，與對照組相比較，有統計學差異（P＜0.01）；一次性給予清肝通絡飲[25 g、12.5 g、6.25 g生藥/（kg·d）]，未能顯著降低SHR大鼠收縮壓，與模型組比較，無統計學差異（P＞0.05），一次性給予纈沙坦[15 mg/（kg·d）]能夠顯著降低SHR大鼠收縮壓，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.01），其中藥后3 h時收縮壓降到最低，結果見表2。

3.1.2 連續給藥10周對SHR收縮壓的影響 結果顯示，模型組SHR收縮壓顯著升高，與對照組相比較，有顯著性差異（P＜0.01）；清肝通絡飲[25 g生藥/（kg·d）]在第1周、第5周降低 SHR收縮壓，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05～0.01）；清肝通絡飲[6.25 g生藥/（kg·d）]在第1周、第7周、第8周能降低SHR收縮壓，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05）；其余測量周內，清肝通絡飲[25 g、12.5 g、6.25 g生藥/（kg·d）]，未能降低SHR收縮壓，與模型組比較，均無統計學差異；連續給予纈沙坦[15 mg/（kg·d）]，在第2周、第5～10周內，均能顯著降低SHR大鼠收縮壓，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05），結果見表 3。

3.2 清肝通絡飲對SHR大鼠心臟功能的影響 結果顯示，模型組SHR的心功能顯著下降，與對照組相比較，有統計學差異（P＜0.01）；清肝通絡飲[25 g、12.5 g、6.25 g生藥/（kg·d）]，能顯著升高SHR的EF、FS值，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05～0.01）；給予纈沙坦[15 mg/（kg·d）]，也能夠顯著升高SHR大鼠EF、FS值，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05）。結果見表 4。

3.3 清肝通絡飲對SHR大鼠心臟形態學的影響

3.3.1 左室內徑 結果顯示，各組大鼠Lvid.d無統計學差異（P＞0.05）。模型組大鼠的Lvid.s明顯增大，與對照組相比較，有統計學差異（P＜0.05）；清肝通絡飲[25 g、12.5 g、6.25 g生藥/（kg·d）]能顯著降低SHR的Lvid.s，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05～0.01）；連續給予纈沙坦[15 mg/（kg·d）]，也能夠顯著降低SHR大鼠Lvid.s值，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05）。見表 5。

3.3.2 室間隔厚度、左室后壁厚度 結果顯示,各組大鼠 Ivsd、LvPw.d、LvPw.s均無統計學差異（P＞0.05）。模型組大鼠的Ivss顯著變小，與對照組相比較，有統計學差異（P＜0.05）；清肝通絡飲[25 g、12.5 g、6.25 g生藥/（kg·d）]能顯著增加SHR的Ivss，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.01）；給予纈沙坦[15 mg/（kg·d）]，也能夠顯著增加SHR大鼠Ivss，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05）。結果見表6。

3.3.3 左心室質量、左心室容積 結果顯示，各組大鼠Vol.d無統計學差異（P＞0.05）。模型組大鼠的Lv mass顯著增加，與對照組相比較，有統計學差異（P＜0.05）；其余各組與模型組無統計學差異（P＞0.05）。模型組大鼠Vol.s明顯增加，與對照組相比較，有統計學差異（P＜0.05）；清肝通絡飲[25 g、12.5 g、6.25 g生藥/（kg·d）]，與模型組相比較，Vol.s明顯下降，有統計學差異（P＜0.05）。給予纈沙坦[15 mg/（kg·d）]，也能夠顯著降低SHR大鼠Vol.s，與模型組比較，有統計學差異（P＜0.05）。結果見表7。

3.4 清肝通絡飲對SHR大鼠血脂的影響 結果顯示，清肝通絡飲、纈沙坦對各組大鼠血脂無顯著影響（P＞0.05）。結果見表 8。

表4 清肝通絡飲對SHR心臟功能的影響（±s）

表4 清肝通絡飲對SHR心臟功能的影響（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 劑量[g生藥/（kg·d）]n EF（%）FS（%）對照組 - 6 73.08± 7.29 43.47± 6.27模型組 - 7 54.76±12.94** 29.88± 9.11**纈沙坦組 0.015 7 68.43±10.13# 39.95± 8.82#消肝通絡飲組 25 8 69.96±6.49## 40.63±5.45#12.5 8 72.90±11.62## 43.78±10.13##6.25 6 68.85±11.47# 39.93± 8.40#

表5 清肝通絡飲對SHR的左室內徑的影響（±s）mm

表5 清肝通絡飲對SHR的左室內徑的影響（±s）mm

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 劑量[g生藥/（kg·d）]n Lvid.d Lvid.s對照組 - 6 6.58±1.00 3.76±0.93模型組 - 7 6.96±0.74 4.86±0.73*纈沙坦組 0.015 7 6.74±0.34 4.06±0.70#消肝通絡飲組 25 8 6.45±0.70 3.81±0.41#12.5 8 6.21±0.77 3.49±0.80##6.25 6 6.16±1.02 3.76±1.09#

表6 清肝通絡飲對SHR室間隔厚度、左室后壁厚度（mm）的影響（x±s）mm

表7 清肝通絡飲對SHR左心室質量、左心室容積的影響

4 討論

清肝通絡飲方中鉤藤、菊花、夏枯草、決明子、梔子、黃芩均有清肝火的功效，鉤藤又能平肝陽；川牛膝、地龍、土鱉蟲、丹參、益母草活血；川牛膝還可引血下行；地龍、土鱉蟲、桑枝、威靈仙通絡；益母草、茯苓利水以防血瘀化水，茯苓還有健脾、安神功效；川牛膝、杜仲補益肝腎以制肝火[5]。諸藥合用，共成清肝火、通絡逐瘀之劑，針對肝火型高血壓，對血壓的控制取得較好療效，隨證加減藥味，若眩暈明顯者，加天麻、牡蠣；清晨血壓偏高，血脈瘀滯較重者，加用三棱、莪術；昏沉欲眠者，加當歸、川芎、白芍、郁金、石菖蒲；頭痛顯著者，加蔓荊子、川芎以止痛。

表8 清肝通絡飲對SHR大鼠血脂的影響（±s）mmol/L

表8 清肝通絡飲對SHR大鼠血脂的影響（±s）mmol/L

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別劑量[g生藥/（kg·d）]n TC TG HDL LDL對照組 - 6 1.28±0.49 0.43±0.07 0.99±0.19 0.40±0.07模型組 - 7 0.97±0.22 0.30±0.08** 0.50±0.12** 0.29±0.05*纈沙坦組 0.015 7 0.88±0.20 0.28±0.09 0.48±0.10 0.24±0.05消肝通絡飲組 25 8 1.00±0.30 0.37±0.08 0.56±0.15 0.26±0.08 12.5 8 1.08±0.23 0.26±0.04 0.58±0.11 0.29±0.11 6.25 6 0.86±0.39 0.21±0.05 0.48±0.17 0.24±0.10*

4.1 動物模型選擇 高血壓病的病因病機一直未完全闡釋清晰，為了更好的研究其發病機制、防治和預后，選擇合適的動物模型是關鍵[7-8]。用于高血壓的動物模型有不同種屬如：高血壓大鼠模型、高血壓犬模型、高血壓兔模型、高血壓羊模型、高血壓靈長類模型等[9]。SHR是目前應用最廣泛的高血壓動物模型，幾乎適用于所有的高血壓相關的實驗研究[10-11]。SHR大鼠[12]發生高血壓幾率高，收縮壓可達到200 mmHg，4周齡期間可出現心臟質量增加以及心血管病變，無明顯的原發性腎損傷，且具有穩定性，同時能形成典型的高血壓并發癥，主要累及心、腦、腎等器官。SHR是研究原發性高血壓、篩選治療高血壓藥物的理想動物模型，和人類原發性高血壓有諸多相似之處[13-15]：1）兩者病因特點均有多基因遺傳傾向。2）兩者病程特點相似，血壓隨年齡增長。3）兩者隨疾病發展會出現器官損傷及并發癥。兩者差異性：1）SHR為選擇性繁殖得到，與人類發病有區別。2）SHR的免疫功能存在異常。3）SHR飼養條件較高，價格貴，遺傳育種麻煩，易變種或斷種，大批量使用存在一定困難。

本實驗以探究清肝通絡飲在動物實驗上的降壓作用。在進行相關實驗時，模型的選擇很重要。同一實驗在不同的模型身上可能得到不同的結果，得出完全不同的結論，結合本次實驗的特點和實驗條件的合理性，選取了SHR為模型，以盡量確保實驗結果和結論的正確性及可信性。

4.2 血壓測量方法的選擇 實驗大鼠動物血壓的測量主要有兩種方法：直接測量法和間接測量法。間接測量方法避免了創傷和麻醉對血壓的影響，操作簡單易行，實驗動物可反復使用，較適用于慢性動物實驗[16]。本實驗選用無創法測量大鼠尾動脈血壓，能夠獲取實驗動物在清醒狀態下的血壓值，但血壓易受動物情緒的影響，測得血壓值同時存在一定誤差。

4.3 動物實驗結果分析 單次灌胃給藥后，清肝通絡飲各組大鼠的SBP值無明顯變化，纈沙坦組大鼠的SBP值有統計學差異（P＜0.01），藥后2～4 h內，SBP值明顯下降，4～6 h內，SBP值逐漸上升至單次給藥前。這一變化同纈沙坦的藥理研究作用效果相同[17]，患者服用纈沙坦膠囊后，藥物在體內經過吸收，2 h可達到峰值，纈沙坦作用效果較緩慢，4周左右才能達到降壓效果[18]。

連續10周灌胃給藥后，在實驗第5周，所有實驗大鼠血壓值普遍升高，可能有以下兩點原因：1）可能與測量環境相關，雖盡量保持測量環境安靜，但第5周血壓測量時，實驗室周邊有不可避免的聲音干擾，為保持實驗數據完整性、時間的連續性，未停止當日的血壓測量。2）高血壓的發病隨季節變化而變化，春季為高血壓的高發期，第5周血壓測量時間為季節轉換較明顯時期，故可能與季節變化相關[19]。連續灌胃給藥10周，清肝通絡飲均未明顯降低SHR血壓，究其原因，可能有以下幾點：首先是動物與人體的差別，盡管SHR模型的病因、病程、并發癥等方面與人體發病有諸多相似之處，但是生物機體本身的存在差異，故在人體上能有效降低血壓的藥物可能在實驗動物上體現不顯著或難以體現。其次由于清肝通絡飲是由15味藥物組成的大復方，藥味較多，方內含有土鱉蟲、地龍等蟲類藥物，故干預藥物之間的氣味、口感的差異對實驗結果可能存在影響，本實驗動物易激惹，每次灌胃給藥及定期的血壓測量動物會產生抵抗，造成心理情緒的抵觸，可能會加重肝陽上亢的證型，使血壓暫時性升高，無法反映動物平時真正的血壓，造成血壓降低不顯著這樣一假象，鑒于臨床試驗在開展過程中，對安慰劑有一定選擇性要求[20-22]，故在進行動物藥理實驗研究時，也應考慮到空白組、對照組、陽性藥組的藥物與中藥實驗組的藥物的口感、氣味等方面的差異性，如果對照組能選擇與中藥濃度和口味一致的溶劑將會得到更加準確的實驗結果。最后可能跟劑量有關，給藥的劑量偏大影響了大鼠正常進食。以上是對本次實驗血壓值的分析結果，尚需要進行更多次、更多劑量及不同動物的實驗進行驗證此實驗結果。

臨床上，中藥復方的應用，常常不是單味中藥發揮療效，而是通過多條途徑、多個作用靶點而產生的整體調節作用[23]，共同發揮作用，中藥復方多作用平緩、毒副作用相對較小，由于其多組分的優點，在調節血壓的同時，緩解其他系統的失衡所致的疾病，適當的發揮保護臟器作用。清肝通絡飲雖未提示降壓療效，但實驗結果顯示其具有保護左心的功能。高血壓大鼠隨年齡增長，會出現心臟受損的現象[6]。左心肥厚是高血壓引起心室重構的結果，心室重構是由于一系列復雜的分子和細胞機制而導致的心室形狀改變以及心功能降低。心室重構初期心腔無明顯增大，心室壁增厚[24]，故心臟功能性改變較明顯，形態學損傷有待于延長實驗周期以觀察。清肝通絡飲改善心室結構，保護心肌的具體作用機制，需后期實驗進一步探討。

前期臨床試驗研究表明，清肝通絡飲對患者的血脂有一定的調節作用，本次實驗，監測SHR血脂、腎功能等指標。本實驗使用動物為SHR，大鼠未進行高脂造模，其各項生化指標應在正常范圍內波動。無論是本次實驗的數據分析，還是通過與其他文獻比較，發現生化指標實驗數據的波動性較大[25-26]。國內、國外[27-28]發表了多篇關于血液、血生化指標檢測的相關文章，實驗結果差別比較大，可能是由于各個實驗室相比，實驗動物的來源、飼養環境、實驗方法等均有所差異。因此對本次實驗結果的指導意義不大，建立實驗室自己的實驗數據庫具有更實際的意義[29]。

中藥復方治療高血壓病，不是每一味中藥作用的簡單相加，它是通過多途徑、多靶點的整合調節，發揮緩和的降壓作用，與化學藥物相比，毒副作用相對小，適合長期服用；而且由于中藥復方本身的多組分特點，在其發揮降壓作用的同時，有效地調整著較高血壓水平所導致的其它系統的失衡狀態，發揮其臟器保護作用。根據中醫的整體觀念應用中藥方劑對疾病進行辨證論治，有著西醫無法比擬的優勢[29]。本實驗在一定程度上反映清肝通絡飲對心臟的保護作用，其降壓作用未明確顯示，臨床上還需收集足夠的資料，再進一步探索研究。