二甲雙胍通過IGF-1R STAT3信號通路抑制前列腺癌生長的實驗研究

蔣東方，卜 強，曾明輝，秦鎖炳，夏東東，彭 毅

目前，前列腺癌發(fā)病率在全世界男性惡性腫瘤中位居第2[1]。隨著我國逐步進入老齡社會，預計10年后前列腺癌的每年新發(fā)病例將達到60～70/10萬[2]。與歐美國家不同，國人中約30%的前列腺癌患者初診時已屬侵襲性前列腺癌，手術機會少，預后差。因此，研究適合國情的前列腺癌個體化診療方案迫在眉睫。二甲雙胍是廣泛用于治療2型糖尿病的雙胍類藥物。除了能降低血糖外，研究表明，二甲雙胍在多種腫瘤中具有抗癌作用，能顯著提高合并2型糖尿病的惡性腫瘤患者的生存率，其中包括前列腺癌[3-4]。大量研究證明，胰島素樣生長因子受體（IGF-1R）在包括前列腺癌、乳腺癌、直腸癌等多種惡性腫瘤組織中異常高表達[5]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細胞中的IGF-1R被上游信號通路激活后，自身的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化[6]，從而促進癌細胞生長。目前二甲雙胍對前列腺癌的作用及其相關機制尚未闡明，本研究通過建立小鼠前列腺癌腫瘤模型，分析IGF-1R/STAT3信號通路是否參與二甲雙胍對前列腺癌細胞的抑制作用，探索二甲雙胍抑制前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 前列腺癌細胞株DU145由上海中科院細胞庫提供，培養(yǎng)于含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基中，37℃、5%C02、飽和濕度。取處于對數期生長的DU145細胞，加入0.25%胰酶消化3 min，1000 r/min離心3 min，棄上清，PBS洗滌細胞，用細胞計數板進行細胞計數，調整細胞濃度至2×107/ml。

1.2 前列腺癌小鼠模型的建立 18只雄性SPF級BALB/c裸鼠（4～6 w齡）購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心（動物合格證號：2008001658794），均飼養(yǎng)于恒溫（25～27 ℃）、恒濕（25%～50%）和無特殊病原菌（SPF）條件下。于注射腫瘤細胞前，高糖飲食2 d，消毒裸鼠，用無菌套管針抽吸上述DU145細胞懸液200 μl，接種于實驗鼠右腹股溝皮下，觀察腫瘤生長情況。7 d后，將荷瘤裸鼠編號后，按不同處理方式隨機分為對照組、二甲雙胍組、PPP組，每組6只。對照組給予100 μl生理鹽水，二甲雙胍組給予50 μl生理鹽水+50 μl二甲雙胍（250 mg/kg），PPP 組給予 50 μl生 理 鹽 水+50 μl 0.1 μM 鬼 柏 苦 （picropodophyllin，PPP），每日瘤內注射1次，每周稱重小鼠。二甲雙胍購自上海信誼藥廠有限公司（國藥準字H20050699），PPP購自Sigma-Aldrich公司。

1.3 檢測指標

1.3.1 腫瘤生長情況 接種DU145細胞后3 w，處死小鼠，取出種植瘤并稱質量。用游標卡尺測量腫瘤的長軸（L）和短軸（W），按公式 V=1/2×LW2計算腫瘤體積。腫瘤組織移至凍存管中，保存于液氮待用。同時觀察實驗過程中，小鼠的體重、飲食、活動等情況。

1.3.2 qRT-PCR檢測IGF-1R和STAT3 mRNA腫瘤組織提取總RNA后，逆轉錄獲得cDNA，逆轉錄試劑盒為PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit，購自大連寶生物公司。采用qR T-PCR進行mR NA定量分析，SYBRPremixExTaqII（TliR NaseHPlus）試劑盒購自大連寶生物公司；PCR引物由上海生工生物合成，序列如下，IGF1R：F：5'-ATGCTGTTTGAA C TGATGCGCA-3'，R：5'-GCCCCCGGCGTTCTTGCTC GCC-3'，354 bp；STAT3：F：5'-TTCTGGGCACAAACAC A AAAG-3'，R：5'-TCAGTCACAATCAGGGAAGC 3'，145 bp；GAPDH：F：5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，R：5'-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3'，169 bp。 在ABI7500快速型實時定量PCR儀進行檢測。根據PCR儀測得的 Ct值，使用 2-⊿⊿Ct法計算IGF-1R和STAT3 mR NA相對表達水平。

1.3.3 Western blot檢測IGF-1R β和Stat3蛋白

提取腫瘤組織總蛋白，以GAPDH為內參，檢測腫瘤組織中IGF1R、STAT3蛋白表達情況。一抗IGF-I R eceptor β （111A9）Mouse mAb、Stat3 （124H6）Mouse mAb（稀釋比例 1:1000）和二抗 Anti-Mouse IgG，HR P-linkedAntibody（稀釋比例1:5000）均購自CellSignaling Technology （CST）公司。 用 Image-Pro Plus軟件分析各樣品的目的蛋白、內參蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。

1.3.4 ELISA檢測血清IL-6和TNF-α 小鼠處死前，采集小鼠腹主動脈外周血2 ml，3000轉/min離心5 min，收集血清，置于-80℃待用。采用雙抗體夾心法檢測IL-6和TNFVα ELISA水平，試劑盒購自Biolegend公司。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量數據以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，采用LSD-t法進行兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組腫瘤生長情況比較 在實驗過程中，3組體重無明顯差異（P＞0.05，表1），飲食及活動均正常，均表現(xiàn)出良好的耐受性。小鼠經不同處理3 w后，與對照組相比，二甲雙胍組與PPP組的腫瘤大小、體積明顯減小（P＜0.05），而二甲雙胍組與PPP組間比較無顯著差異（P＞0.05，表2）。

表2 各組腫瘤大小和體積比較

2.2 3組 IGF1R、Stat3蛋白和 IGF-1R、STAT3 mR NA表達水平比較 Western blot實驗結果表明，二甲雙胍能顯著降低IGF-1R和Stat3蛋白的表達（P＜0.05），PPP組 IGF-1R和 Stat3表達量亦顯著降低（P＜ 0.05，圖 1）。

qPCR實驗結果表明，二甲雙胍組與PPP組的IGF1R、STAT3 mR NA表達顯著低于對照組（P＜0.05），二甲雙胍組STAT3 mR NA表達顯著低于PPP組（P＜0.05），但二甲雙胍組IGF1RmR NA顯著高于PPP組（P＜0.05）。 見表3。

圖1 Western blot電泳圖

表1 各組不同處理后體重變化（g）

表33 組IGF1R、Stat3蛋白和IGF-1R、STAT3mRNA表達水平比較

2.3 3組血清IL-6和TNF-α水平比較 二甲雙胍組血清IL-6顯著低于對照組和PPP組（P＜0.05），對照組和PPP組IL-6比較無顯著性差異（P＞0.05）；3組間 TNF-α 比較無顯著差異（P＞ 0.05，表 4）。

表33 組血清IL-6和TNF-α水平比較

3 討論

二甲雙胍為一種胰島素增敏劑，可改善患者的胰島素抵抗，降低其體內高胰島素血癥。近年來研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抗癌作用，其可能的抗癌機制是：激活AMP活化的蛋白激酶（AMPK），進而抑制mTOR通路活性[7]，抑制惡性膠質瘤的生長和轉移；下調細胞周期蛋白D1，使卵巢腫瘤細胞有絲分裂受抑制[8]。二甲雙胍通過介導AMPK減少肝臟糖異生，并刺激肌肉組織攝取葡萄糖，降低空腹血糖及胰島素水平。在高胰島素濃度的環(huán)境下，腫瘤細胞膜表面的胰島素受體（IR）和IGF1R結合后，可激活下游ERK和PI3K等信號通路，促進腫瘤細胞的惡性進展[9]。IGF1和IGF2是正常機體組織中骨骼肌生長、分化的重要因子，然而研究表明，在多種腫瘤組織中存在IGF-1R的過表達現(xiàn)象，使得封閉IGF-1R活性的靶向治療成為腫瘤治療的研究熱點。PPP是一種環(huán)木脂體，抗腫瘤活性天然產物鬼臼毒素的差位異構體，可通過抑制IGF-1R活性及其下游信號通路Akt、Erk 活化，從而誘導腫瘤細胞凋亡[10]，因此，在本實驗中作為陽性對照。本研究結果顯示，經二甲雙胍和PPP處理后，小鼠前列腺腫瘤大小、體積明顯縮小，證實二甲雙胍具有抑制前列腺癌生長的作用，并且小鼠耐受性較好，表明二甲雙胍和PPP較安全，毒性作用小。

二代抗雄激素藥物恩雜魯胺能顯著抑制前列腺癌的進展，然而因恩雜魯胺耐藥的發(fā)生，導致其僅能延長患者4～6個月生存期。有研究顯示，二甲雙胍能增強恩雜魯胺的抑制作用，可通過抑制恩雜魯胺誘導的STAT3活化以及抑制TGF-β1表達，從而抑制上皮向間葉轉化[11]。為進一步研究二甲雙胍抑制前列腺癌生長的機制，本實驗分析了IGF-1R/STAT3通路活化情況以及下游細胞因子代謝，探討其是否參與二甲雙胍抑制腫瘤的過程。PCR結果顯示，二甲雙胍和PPP能顯著下調前列腺癌中IGF-1R、STAT3 mRNA的表達，其中PPP對IGF-1R的抑制作用強于二甲雙胍。Western blot結果顯示，二甲雙胍和PPP處理后，腫瘤細胞IGF-1R、Stat3表達量亦顯著降低，表明IGF-1R/STAT3通路在二甲雙胍抑制前列腺癌生長過程中具有重要作用。

STAT3通路是IL-6、TNF-α的主要分子途徑，參與調節(jié)細胞的生長、增殖和凋亡抵抗，IL-6、TNF-α表達水平異常與前列腺癌的進展有密切關聯(lián)。本研究結果表明，二甲雙胍可顯著降低前列腺癌小鼠血清中IL-6的表達。

綜上所述，二甲雙胍可通過下調IGF-1R/STAT3信號通路以及IL-6的表達，有效抑制前列腺癌的生長，且二甲雙胍經濟、安全、毒性小，對前列腺癌的治療作用值得深入研究。