E-選擇素G98T位點基因多態性與乙肝HBV-DNA載量的相關性研究

郭清江

乙肝是目前全球范圍內一個不容忽視的公共健康問題，患者往往乙肝病毒檢測呈陽性，病程＞6個月或發病日期不明確但有臨床癥狀表現[1]。全世界70%～80%的肝硬化以及肝癌患者是由乙肝發展而致，相關死亡人數則高達60萬/年，且仍然處于上升態勢[2]。由于該病癥為多因素作用所致的感染性疾病，目前已知多種細胞因子基因多態性與其相關，如腫瘤壞死因子、白細胞介素等[3]。E-選擇素是近年新出現的一種炎癥細胞因子，其表達水平的升高將會介導炎癥以及免疫細胞的浸潤。當E-選擇素基因第2外顯子5′非翻譯區98位點G發生突變時，引發G98T位點基因多態性，并對E-選擇素表達水平產生直接影響，進一步增強后者所致的炎癥反應及浸潤能力。HBV-DNA載量可反映乙肝病毒的復制能力[4]。由于炎癥反應在乙肝發生、發展中扮演著重要的角色，所以，有理由相信E-選擇素G98T位點基因多態性與HBV-DNA載量之間存在著某種關聯性，本研究對此進行了探討。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取醫院2016年3月～2017年3月收治的80例乙肝患者作為觀察組，其中男57例，女 23 例；年齡 38～64（50.24±1.16）歲；病程時間0.5～2.5（1.10±0.12）年；主要癥狀表現：肝區不適 11例，上腹部疼痛19例，乏力40例。納入標準：（1）經臨床診斷確診為乙肝者；（2）民族為漢族；（3）同意此次研究方案并簽署知情同意書者。排除標準：（1）甲、丙、丁、戊型肝炎者；（2）合并全身嚴重器質性疾病者；（3）混合或重疊感染者。另選同期于本院體檢的80例健康體檢者為對照組，其中男60例，女20例；年齡 40～65（50.25±1.15）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異不顯著（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集 觀察組于住院第2 d上午6:00～8:00，對照組于體檢當天上午6:00～8:00抽取空腹靜脈血5 ml，置于促凝試管中，待血液徹底凝固后，2500 r/min離心10 min，采集血清，置于-20℃中備用。

1.2.2 E-選擇素G98T位點基因多態性測定 首先進行E-選擇素G98T位點基因DNA提取工作，吸取800 μl紅細胞裂解液至容量為1.5 ml的離心管之中，取出冷凍的血液樣本并恢復至室溫狀態，吸取400 μl樣本至該離心管中倒置，輕彈管壁以促使二者充分混勻。在室溫條件下靜置10～15 min以待紅細胞徹底裂解。以12 000 r/min離心30 s，去除上清液并留下白細胞團，渦旋振蕩20 s后重懸處理，加入250 μl細胞核裂解液后用力吹打數次以促使白細胞充分裂解[5]。顛倒離心管10數次后加入100 μl蛋白沉淀液，渦旋振蕩 30 s，以 13 000 r/min離心10 min，取一支無菌干凈同規格的離心管，吸取上清液500 μl后置入該管，加入200 μl異丙醇（室溫），適度用力混勻后以12 000 r/min離心60 s并去除上清液[6]。向其加入0.5 ml的70%乙醇，反復顛倒數次后漂洗處理以促使DNA沉淀，再次以相同轉速離心60 s，去除上清液，殘余乙醇自然風干。向由DNA提取的沉淀物之中加入100 μl溶解液，促使其重新水化后輕彈離心管壁以促使其混勻，于65℃孵育0.5～1 h[7]。最后利用1%瓊脂糖凝膠電泳對DCA提取液進行定型鑒定，具體步驟如下：取10 ml溶液后加入上樣緩沖液1 ml，適度用力混勻后置于電泳儀內，電壓為130 V，待0.5 h后去除，并在凝膠成像儀下觀察鑒定結果[8]。

1.2.3 E-選擇素G98T位點基因組擴增 E-選擇素G98T位點基因上下游引物的合成由上海生工生物有限公司完成，擴增條件設定為94℃預變性600 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s、35 個循環，完畢后 72 ℃延伸600 s，5℃下終止反應并保存，利用2%瓊脂糖凝膠電泳顯示結果[9]。隨后于37℃下孵育10 h并進行限制性酶切處理，130 V電泳0.5 h，凝膠成像儀下鑒定基因型（AA型、AC型）。

1.2.4 HBV-DNA載量分析 利用豪夫邁.羅氏公司生產的Lightcycler 480熒光定量PCR儀對HBVDNA載量進行測定，檢測試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供。

1.3 觀察指標 將兩組受試者E-選擇素G98T位點基因型與基因頻率、觀察組內不同基因型HBVDNA載量、不同HBV-DNA載量基因型與基因頻率作為觀察指標。

1.4 統計學方法本研究中所有數據均應用SPSS17.0統計軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，行t檢驗，計數資料用例和百分率表示，行χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組E-選擇素G98T位點基因型與基因頻率比較 兩組E-選擇素G98T位點基因型與基因頻率相比較，觀察組AA基因型占比、A等位基因頻率低于對照組，AC基因型占比、C等位基因頻率高于對照組（P＜ 0.05），見表 1。

表1 兩組E-選擇素G98T位點基因型與基因頻率比較［n（%）］

2.2 觀察組內不同基因型HBV-DNA載量 觀察組內AA基因型患者HBV-DNA載量為（1.92±0.28）×103copy/ml，而 AC 基因型為（6.33±0.27）×103copy/ml，二者相比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 觀察組內不同HBV-DNA載量患者基因型與基因頻率比較 依據HBV-DNA正常上限值（1×103copy/ml），＜1×103copy/ml者 AA 基因型占比及 A等位基因頻率高于≥1×103copy/ml者，AC基因型占比、C等位基因頻率低于≥1×103copy/ml者（P＜0.05），見表 2。

3 討論

乙肝是目前全球范圍內一個不可回避的公共衛生疾病，據統計全世界約有三分之一的人群既往或現在存在感染乙型病毒肝炎的血清學證據，3.5億人成為乙肝病毒攜帶者，與之相關的終末期肝病或肝癌致死人數每年高達100萬[10]。所以明確其發病機制并采取行之有效的干預措施與遏制乙肝發病率及病死率的過快增長成為當務之急[11]。現有研究指出，炎癥細胞因子與乙肝的發生、發展存在著密切的關聯性，而E-選擇素則是目前醫學界全新發現的一種炎性細胞因子，參與到了多種白細胞以及T淋巴細胞亞群的黏附與凝集，促使二者相互作用[12]。Lucio Boglione等[13]在其研究中證實，E-選擇素表達水平的改變預示著細胞表明成分的翻轉以及蛋白質的水解，在疾病早期活動之中發揮了至關重要的促進作用。尤其是隨著分子生物學的快速發展，E-選擇素基因多態性日益受到醫學界的重視與關注。G98T位點基因多態性為E-選擇素基因第2外顯子5′非翻譯區98位點G突變所致，該位點并不會直接翻譯成蛋白質，但卻能夠通過對基因表達水平的直接調控來影響E-選擇素的表達，使得后者介導的黏附凝集作用大幅增強，最終導致E-選擇素表達水平上揚而引發炎癥反應[14-15]。然而，E-選擇素G98T位點基因多態性是否與乙肝的發生、發展存在相關性因現有研究較少，目前尚不得而知。所以，圍繞此方面內容展開分析無疑具有重要的研究價值。

表2 觀察組內不同HBV-DNA載量患者基因型與基因頻率比較［n（%）］

本研究通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術對乙肝患者（觀察組）以及健康體檢者（對照組）E-選擇素G98T位點基因多態性進行檢測發現，兩組E-選擇素G98T位點基因型與基因頻率相比較，觀察組AA基因型占比、A等位基因頻率低于對照組，AC基因型占比、C等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示E-選擇素G98T位點基因多態性與乙型肝炎病毒感染之間存在著一定的關聯性，等位基因C可能為慢性乙型肝炎的重要遺傳易感因素。在HBV-DNA載量比較上，觀察組內AA基因型患者HBV-DNA載量為（1.92±0.28）×103copy/ml，而 AC 基因型為（6.33±0.27）×103copy/ml，二者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。依據HBV-DNA載量，依據HBV-DNA正常上限值（1×103copy/ml），＜1×103copy/ml AA 基因型占比及 A等位基因頻率高于≥1×103copy/ml者，AC基因型占比、C等位基因頻率低于≥1×103copy/ml者，差異亦有統計學意義（P＜0.05），提示臨床AC位點多態性可能增強HBV-DNA復制能力。

綜上所述，E-選擇素G98T位點基因存在多態性，AC位點多態性可能增強HBV-DNA復制能力。