南美白對蝦貯藏過程中揮發性物質的變化

葛敏敏,王建華,劉靖靖,王 穎,李 曉,湯志旭

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266001; 2.青島海關檢驗檢疫技術中心,山東青島 266002; 3.山東省海洋生物研究院,山東青島 266000)

南美白對蝦(Penaeusvannamei),又稱凡納濱對蝦,不僅蛋白質含量高，而且含有豐富的多不飽和脂肪酸及鎂、鈣、磷、碘等微量元素,營養價值非常高。但因其水分、蛋白質含量高,組織蛋白酶活性較強等特點,南美白對蝦不易貯藏,易于腐敗變質產生異味,影響其品質。

固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)是20世紀90年代初由加拿大Watrloo大學Pawliszyn所在科研小組研發的無溶劑的樣品前處理技術[1],集萃取、濃縮、解析為一體,是目前應用最廣泛的海產品揮發性成分的提取方法。Mall[2]、藺佳良[3]利用SPME技術，分別研究了不同加工方式下的的南美白對蝦的揮發性風味物質,贠三月[4]研究了南美白對蝦不同部位的揮發性風味物質,而朱亞珠[5]、郭美娟[6]利用SPME技術，分別研究了室溫貯藏下毛蝦蝦皮、25 ℃貯藏條件下南美白對蝦揮發性物質的變化。目前對蝦的揮發性物質研究主要集中在風味物質的研究上,而對其貯藏過程中揮發性物質變化研究較少。對于揮發性物質定性,目前通常都要求GC-MS分析未知揮發性化合物時計算保留指數(retention index,RI),認為GC-MS結合RI及標準品的匹配法進行定量分析是可信度最高的方法[7]。

對于特征揮發性物質的篩選,Kuuliala[8]采用聚類分析、主成分分析、偏最小二乘回歸分析(PLS)對不同氣調包裝(4 ℃ 貯藏)條件下褐蝦和大西洋鱈魚揮發性物質分析,找出多種腐敗的潛在標記物質;主成分分析法是一種將多個指標化為少數互相無關的綜合指標的統計學方法,在揮發性物質分析中得到廣泛應用[9-10],朱丹實[11]利用揮發性物質與(total volatile base nitrogen,TVB-N)相關性分析得出多種新鮮度指示物。

本實驗采用HS-SPME-GC-MS并結合RI定性的方法,分析4 ℃ 貯藏南美白對蝦0～12 d揮發性物質變化情況,并且利用主成分分析和相關性分析方法進行揮發性物質的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦 山東東營養殖;正己烷(色譜純)上海植茂環保科技有限公司;正庚烷(色譜純)上海麥克林生化科技有限公司;C8～C36正構烷烴(色譜純) 美國色譜科公司;三甲胺鹽酸鹽(98%) 上海麥克林生化科技有限公司。

帶有Agilent PAL3自動進樣系統的7890A-240氣相色譜質譜聯用儀 美國安捷倫公司;2300全自動凱氏定氮儀 瑞典福斯集團公司;50/30 μm二乙烯苯(DVB)/碳分子篩(CAR)/聚二甲基硅烷(PDMS)萃取頭 美國色譜科公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南美白對蝦的貯藏和揮發性物質的萃取 南美白對蝦蝦解凍,瀝干水分,放置于4 ℃冰箱中貯藏,每天測其揮發性物質(0～12 d)。將蝦去除頭部、尾部、蝦殼,打碎稱取2.00 g于頂空進樣瓶中,50 ℃條件下,平衡5 min,萃取50 min;進樣口解析5 min(250 ℃),用GC-MS進行分離鑒定。

1.2.2 揮發性物質的分離與檢測 采用GC-MS對揮發性物質進行分離和檢測。色譜條件:色譜柱為HP-5 毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);程序升溫模式,初始40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至220 ℃,保持5 min;進樣口溫度250 ℃;He為載氣,流速是0.8 mL/min,不分流模式進樣。質譜條件:電離方式為EI,電離能量為70 eV;接口溫度為280 ℃;離子阱溫度為200 ℃;質量掃描范圍為35～300 m/z。

1.2.3 揮發性物質的定性和定量 揮發性物質經NIST14譜庫檢索與保留指數定性,其中匹配率>800(完全匹配為1000),所有文獻中的保留指數信息均在NIST14查得;以峰面積進行定量分析。

保留指數計算公式:IT=100Z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)]

1.3 circRNA的類別 理論上，circRNA可以產生于基因組的任何區域。一個circRNA通常由1～5個外顯子和/或1～2個內含子組成，可能同時含有編碼區或非編碼區成分。根據組成不同可以將circRNA分為內含子環狀RNA (intronic circRNA)、外顯子環狀RNA (exon circRNA)、外顯子—內含子環狀RNA (exon-intron circRNA)和基因間區環狀RNA (intergenic circRNA)4個類別[5]。

式中,TR(z)、TR(z+1)代表正構烷烴的保留時間,TR(x)代表揮發性物質的保留時間,Z代表正構烷烴碳的個數,其中TR(z+1)>TR(x)>TR(z)。

1.2.4 TVB-N的測定 采用全自動凱氏定氮儀按照GB/T 5009.228-2016食品中揮發性鹽基氮的測定[12]測定。

1.3 數據分析

聚類分析法:采用系統聚類的方法,以歐氏距離的平方為度量標準,通過組間連接的方式以66 種揮發性物質作為變量,對樣品0～12 d 6個貯藏階段的揮發性物質進行聚類分析。

主成分分析法:將數據標準化處理后,做因子分析,得到主成分的得分系數矩陣、方差貢獻率、特征值及旋轉成分矩陣,求不同揮發性物質的主成分綜合評價得分(由主成分方差貢獻率對主成分得分加權求平均值得到,記為F),并根據旋轉成分矩陣做主成分分析載荷圖。

利用Excel 2010、SPSS 19、Origin 9軟件對南美白對蝦貯藏過程中肌肉揮發性成分進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 南美白對蝦4 ℃貯藏過程中的揮發性物質

南美白對蝦4 ℃貯藏0～12 d的揮發性物質定性及定量變化見表1,共檢出66種,其中包括醛類12種、醇類11種、酮類9種、酯類10種、酸類2種、烴類7種、含氮物質6種、含硫物質7種、其他2種。

表1 南美白對蝦貯藏過程中肌肉的揮發性物質Table 1 Volatile components of Penaeus vannamei muscle during storage

續表

2.1.1 醛類、醇類、酮類物質 南美白對蝦揮發性物質中的醛類、醇類、酮類物質的種類占揮發性物質的一半,這三類揮發性物質中的脂肪族類物質,主要來源于脂肪氧化。南美白對蝦中多不飽和脂肪酸酶促氧化,生成的醛、酮、醇等化合物主要為C6、C8、C9化合物,其中,C6化合物呈青草味,C8化合物呈蘑菇或紫羅蘭的氣味,C9化合物呈類似黃瓜的香味,這些化合物是新鮮南美白對蝦清香味的主要來源[13],南美白對蝦中此類物質有2-乙基己醇、2-壬酮等物質;脂肪的非酶促氧化,產生的醛酮化合物,以適當濃度存在時可以賦予南美白對蝦特殊的風味,但其含量過高就會使南美白對蝦產生哈喇味,此類的揮發性物質有10-十一烯醛、癸醛、肉豆蔻醛、十五醛、十六醛、十八醛。非脂肪族物質苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇可能來源于苯丙氨酸的Strecker降解的產物[14],其中苯乙醇為儲藏后期(8～12 d)的特征揮發性物質。各種C6～C10醛類、醇類、酮類化合物可能是非微生物來源,而如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛等分子量較小的則與微生物代謝有關[15],其含量的增加是南美白對蝦貯藏過程中微生物代謝累積的結果。

2.1.2 酯類、烴類、含氮類、含硫類及其他類物質 酯類物質來源于脂肪酸和醇類物質的酯化反應,一般具有果香味,對腥味有一定的削減作用。酸類物質僅檢出2種且含量不高,對整個貯藏過程中南美白對蝦新鮮度變化影響不大。烴類主要是烷基自由基的脂質自氧化過程或類胡蘿卜素分解產生,一般閾值較高,通常認為對產品整體風味貢獻不大[16],因此烴類物質含量的變化對南美白對蝦風味的變化影響不大。含氮物質中亞胺脲、三甲胺、吡嗪、吲哚變化程度較大,其含量大致呈上升趨勢,其中亞胺脲可能來源于生物胺(胍基丁胺)的分解;三甲胺是由南美白對蝦中的氧化三甲胺經兼性厭氧菌還原而產生的揮發性含氮物質,其含量的增加會使南美白對蝦腥味加重;吡嗪類化合物賦予產品焦糊味和烤面包味,為美拉德反應產物[17],是南美白對蝦貯藏后期的特征揮發性物質;吲哚具有腐敗臭氣,是由微生物降解蛋白質降解產生[18],其含量增加會使南美白對蝦產生明顯的臭味。含硫物質一般來源于含硫氨基酸的降解,一般具有刺激性氣味,如二甲基三硫化物是魚露特征香味。其他揮發性物質包括苯并噻唑,主要是還原糖在硫化氫和氨存在下,通過熱降解得到的[17]。

揮發性物質還可能來源于環境污染物。有文獻認為，海產品中的萘、苯類化合物是從飼料和環境中轉移積蓄到魚體中,在草魚[19]、鱖魚[20]等多種水產品中均有檢出;二硫化碳、三溴甲烷水體污染物分別在中華鱉[21]、縊蟶稚貝[22]中有檢出。

2.2 揮發性物質變化與新鮮度的相關性分析

2.2.1 揮發性物質的聚類分析 聚類分析結果見圖1,當橫坐標距離為9.5時,南美白對蝦樣品可分為貯藏0～4、5～8、9～10、11、12 d 5個集群,由此可見，通過對揮發性物質變化的聚類分析可區分不同新鮮度的南美對蝦樣品。

圖1 不同貯藏時期南美白對蝦肌肉樣品的聚類分析圖Fig.1 Dendrogram of Penaeus vannamei muscle samples at different storage periods

2.2.2 揮發性物質聚類與TVB-N的相關性 由圖2可知,南美白對蝦貯藏6 d后(包含第6 d)TVB-N含量超過國標30 mg/100 g,并且TVB-N(y)隨時間(x)的變化與冪函數y=9.41e0.21x擬合,擬合度R2=096,說明TVB-N的變化率越來越大。

圖2 貯藏南美白對蝦的TVB-N變化Fig.2 Changes of TVB-N of Penaeus vannamei during storage

以TVB-N作為衡量南美白對蝦的新鮮度的理化指標,南美白對蝦聚類分析的第1個集群為貯藏0～4 d,代表沒有腐敗變質的南美白對蝦;第2個集群為貯藏5～8 d南美白對蝦,代表腐敗的南美白對蝦(除第5 d外都已腐敗變質);第3、4、5個集群分別為貯藏9～10、11、12 d的南美白對蝦,他們都代表嚴重腐敗變質的南美白對蝦。第3、4、5個集群樣品特征值差異較大,說明這三個集群間揮發性物質差異較大,9～12 d揮發性物質的差異越來越大,這與TVB-N變化速率越來越大相一致,說明南美白對蝦貯藏9～12 d相較于貯藏前期新鮮度變化速率加快。

總之,南美白對蝦揮發性物質的變化不僅可以將不同新鮮度南美白對蝦進行歸類,而且可以表征南美白對蝦新鮮度的變化速率。

2.3 特征揮發性物質篩選

2.3.1 根據揮發性物質與新鮮度(即TVB-N)的相關性進行特征揮發性物質篩選 仍以TVB-N作為衡量南美白對蝦的新鮮度的變化的理化指標,將南美白對蝦揮發性物質與TVB-N變化進行相關性分析,極顯著相關(p<0.01)的揮發性物質有29種,見表1。這29種特征揮發性物質中包括16種貯藏過程中(除第0 d外)共有的揮發性物質和13種貯藏過程中出現的揮發性物質。其中共有的揮發性物質可作為南美白對蝦新鮮度相關物質,其含量變化可以用來表征新鮮度的變化;貯藏過程中出現的揮發性物質可根據其在貯藏過程中出現的時間作為南美白對蝦新鮮度節點物質,新鮮度相關物質和新鮮度節點物質種類如表2所示。

表2 南美白對蝦肌肉特征揮發性物質Table 2 Characteristic volatile components of Penaeus vannamei muscle

2.3.2 以主成分分析進行特征揮發性物質篩選 主成分個數的選取要遵循既減少變量的個數又有利于對實際問題的分析和研究的原則,先按累積方差貢獻率不低于某個閥值(比如85%)的原則確定前幾個主成分,然后以每個主成分各自的貢獻率為權數，將選定主成分線性加權求和來綜合評價樣本的優劣[23-24]。對4 ℃ 貯藏南美白對蝦69種揮發性物質進行主成分分析,提取特征值>1的3個主成分(記為F1、F2、F3),如表3所示,3個主成分的總方差貢獻率累積達到 89.72%,故選取F1、F2、F3這3個主成分。

表3 主成分方差貢獻率Table 3 Variance contribution of principal components

由圖3可以看出，南美白對蝦貯藏0～7 d樣品在第2、3主成分上載荷較大,貯藏8～12 d樣品在第1主成分上載荷較大,說明貯藏第0～7 d樣品與第2、3主成分高度正相關,貯藏8～12 d樣品與第1主成分高度正相關。

圖3 不同貯藏時間的南美白對蝦肌肉 揮發性成分主成分分析載荷圖Fig.3 PCA load diagram of volatile components in Penaeus vannamei’s muscle at different storage periods

各揮發性成分得分如表4所示(只分析主成分得分大于1的揮發性物質),吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇與第1主成分相關性最大,亞氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯與第2主成分相關性最大,壬醛、辛醇、二烯丙基二硫與第3主成分相關性最大。由此可以說明，第1主成分代表的揮發性物質有吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇,第2主成分代表的揮發性物質有亞氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯,第3主成分代表的揮發性物質有壬醛、辛醇、二烯丙基二硫。

表4 各揮發性物質主成分得分及排序Table 4 Evaluation results and rank of principal components for volatile components

續表

因此,南美白對蝦貯藏0～7 d樣品的特征揮發性物質為亞氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯、壬醛、辛醇、二烯丙基二硫;貯藏8～12 d樣品的特征揮發性物質為吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇。

主成分綜合評價得分如表4所示,吡嗪、2-乙基己醇、亞氨脲對南美白對蝦貯藏過程整體揮發性物質貢獻較大,可作為南美白對蝦4 ℃貯藏0～12 d整個過程的特征揮發性物質。

3 結論

本研究中共檢出66種揮發性物質,而且大部分揮發性物質都經過過保留指數(RI)定性,并對其來源及變化規律進行分析。南美白對蝦4 ℃貯藏條件下其揮發性物質種類和含量隨之發生變化,通過對樣品揮發性物質變化的聚類分析可將不同貯藏時間的樣品聚類,且聚類情況也與南美白對蝦新鮮度變化一致,說明揮發性物質可以用來表征南美白對蝦新鮮度的變化;利用相關性分析和主成分分析兩種方法進行特征揮發性物質的篩選,分別確定南美白對蝦新鮮度相關物質、新鮮度節點物質和南美白對蝦貯藏各個時間階段及整個階段的特征揮發性物質,為揮發性物質應用于南美白對蝦新鮮度的檢測提供理論基礎。