東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為的影響及其作用靶點

時丹丹 楊 健 張金鈕 王 剛

(首都醫科大學附屬北京安定醫院 國家精神心理疾病臨床醫學研究中心 精神疾病診斷與治療北京市重點實驗室，北京 100088)

抑郁癥(major depressive disorder，MDD)是一種具有高致殘、高復發和高自殺風險的常見慢性精神疾病。世界衛生組織(World Health Organization，WHO)[1]最新發布的數據顯示，MDD全球患病率約為4.4%，患病人數高達3.22億，已成為世界范圍內的首要致殘原因。我國MDD的患病率為4.2%，占總傷殘損失健康生命年(years lived with disability,YLD)的7.3%[2]，給社會和家庭造成極大的經濟負擔，已成為迫切需要解決的重大公共衛生問題。目前抗抑郁藥是一線治療方法，但其總體有效率為60%～70%，且一般需要2～4周才能起效[2-3]，影響患者的依從性，不利于病情的恢復。因此，研發快速起效的抗抑郁藥物是臨床治療抑郁癥的迫切需要。

近年來，多項臨床研究[4-5]證明東莨菪堿(scopolamine)小劑量應用時具有快速抗抑郁效應。東莨菪堿作為毒蕈堿型乙酰膽堿受體(muscarinic acetylcholine receptor，M受體)的非選擇性拮抗劑，與M受體的5種亞型(M1～M5)均有不同程度的親和力，但究竟是哪種M受體亞型介導其抗抑郁作用尚不清楚。以往動物研究更多關注M1受體在東莨菪堿抗抑郁效應中的作用，而針對抑郁癥患者的研究提示M2受體可能與抑郁癥發病更為密切，如抑郁癥患者背外側前額葉皮質的M2結合密度較健康人明顯降低[6-7]，并且M2受體編碼基因CHRM2多態性與抑郁發病顯著相關[8-9]。為明確M2受體是否是東莨菪堿抗抑郁的作用靶點，本研究急性強迫游泳模型，觀察不同劑量M2受體選擇性拮抗劑(methoctramine，MCT)對大鼠抑郁樣行為的影響，并同時探討介導其抗抑郁作用的可能腦區。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康成年Sprague Dawley(SD)雄性大鼠82只，鼠齡8周，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。正常飲食，實驗環境清潔，溫度25 ℃，晝夜交替12 h，飼養1周以適應環境，每籠2～3只。本實驗通過首都醫科大學動物倫理委員會批準(倫理批號：AEEI-2018-017)。

1.2 主要藥品及試劑

微量給藥套管購自瑞沃德公司；微量進樣針購自上海高鴿公司；Scopolamine hydrobromide購自英國Tocris公司(批號：114-49-8)；Methoctramine hydrate(批號：104807-46-7)和Muscimol hydrobromide(批號：18174-72-6)購自美國Sigma公司。

1.3 主要儀器

強迫游泳有機玻璃缸(水深37 cm，桶高50 cm，直徑30 cm)購自武漢普百康科技發展有限公司。大鼠強迫游泳分析軟件EthoVisionXT10購自荷蘭Noduls公司。曠場實驗系統(100 cm×100 cm×40 cm，底部為黑色，四周壁為黑色，無蓋不透明塑料方箱)購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及處理

1)通過強迫游泳實驗明確東莨菪堿的抗抑郁樣作用：將14只正常SD大鼠采用數字表法隨機分為東莨菪堿組和對照組，每組7只，分別腹腔注射25 μg/kg東莨菪堿或等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，24 h后通過曠場實驗和強迫游泳實驗評價東莨菪堿對大鼠抑郁樣行為的影響。

2)利用γ-氨基丁酸-A(γ-aminobutyric acid-A，GABA-A)受體激動劑蠅蕈醇(Muscimol)沉默內側前額葉皮質(medial prefrontal cortex，mPFC)神經元以明確東莨菪堿發揮抗抑郁效應的腦區：將14只正常SD大鼠采用數字表法隨機分為Muscimol+東莨菪堿組和東莨菪堿組，每組7只，在腹腔注射25 μg/kg東莨菪堿前1 h分別向大鼠mPFC立體定位注射Muscimol 1.25 μg或等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，24 h后進行強迫游泳實驗觀察東莨菪堿的行為學效應是否被阻斷。

3)通過M2受體選擇性拮抗劑MCT側腦室注射以明確M2受體是東莨菪堿抗抑郁的作用靶點：將大鼠分為對照組和MCT組，分3批次分別向大鼠側腦室注射0.5 μg/ 2 μL(對照組和MCT組各9只)、1 μg/2 μL(對照組7只，MCT組10只)和2 μg/2 μL MCT(對照組9只，MCT組10只)，對照組均給予2 μL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液。24 h后利用曠場實驗和強迫游泳實驗評價大鼠行為學變化。

1.4.2 手術和給藥

動物稱體質量后，用1%(質量分數)戊巴比妥溶液0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉。根據大腦立體定位圖譜將套管埋置于雙側mPFC(前囟前2.8 mm，旁開3.1 mm，深度3.8mm，傾斜30°角)或者側腦室(前囟后0.9mm，旁開1.5 mm，深度3.5 mm)。大鼠術后休息1周后，通過微量給藥系統經套管向雙側mPFC注射Muscimol或等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，向雙側側腦室注射不同劑量MCT或2 μL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，給藥速度均為0.2 μL/min，給藥后留針5 min。

1.4.3 曠場實驗

用來評定大鼠自發性活動能力。提前將大鼠搬入測試室，使大鼠適應環境至少1 h。將大鼠放入曠場設備中心后，開始記錄5 min內大鼠在曠場內總路程，每次實驗結束用稀釋的乙醇徹底清潔曠場。測試過程采用視頻記錄儀(上海欣軟信息科技有限公司)記錄并分析。

1.4.4 強迫游泳實驗

用來評價大鼠的絕望行為，是評價大鼠抑郁樣行為的重要指標。于正式實驗前24 h將測試大鼠放入25 ℃水中，室溫25 ℃，大鼠懸浮四肢不能觸及桶底，15 min后將大鼠取出、擦干后放回籠中；次日在同樣的條件下進行強迫游泳5 min，記錄5 min內大鼠靜止不動時間(大鼠僅有頭部露出水面，身體飄浮在水中，四肢可有微動但不掙扎)，測試過程采用攝影機記錄，采用荷蘭Noduls公司強迫游泳分析軟件分析數據。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 東莨菪堿對急性強迫游泳模型大鼠的行為學效應

腹腔注射25 μg/kg東莨菪堿或等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液24 h后，兩組大鼠強迫游泳5 min靜止不動時間比較，差異有統計學意義(t=2.940，P=0.024)，詳見表1。曠場總路程比較，差異無統計學意義(t=-1.152，P=0.272)，詳見表2。

GroupNumber of caseImmobility timeCtrl7153.54±98.87Scop741.63±19.12*

*P<0.05vsctrl；Ctrl：control；Scop：scopolamine.

GroupNumber of caseTotal movement distanceCtrl725 313.31±3 498.09Scop727 442.58±3 414.89

Ctrl：control；Scop：scopolamine.

2.2 Muscimol對東莨菪堿處理大鼠的行為學影響

東莨菪堿腹腔注射前1 h向大鼠雙側mPFC分別注射1.25 μg GABA-A受體激動劑Muscimol或等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，Muscimol+東莨菪堿組較東莨菪堿組5 min靜止不動時間明顯增加(t=-3.360，P=0.006)，詳見表3；兩組曠場總路程比較，差異無統計學意義(t=-2.003，P=0.068)，詳見表4。

Group Number of case Immobility time Scop735.74±26.56Mus+Scop7117.66±58.77*

*P<0.05vsScop，Scop：scopolamine；Mus：Muscimol.

GroupNumber of case Total movement distanceScop 726 806.44±2 153.52Mus+Scop731 272.92±5 493.19

Scop：scopolamine；Mus：Muscimol.

2.3 MCT對急性強迫游泳模型大鼠的行為學效應

向大鼠側腦室分別注射不同劑量MCT或等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，觀察其對大鼠行為學影響(表5、圖1)。與0.9%(質量分數)氯化鈉注射液組相比，0.5 μg MCT不影響大鼠強迫游泳不動時間(P>0.05)；1 μg MCT明顯降低大鼠不動時間(P<0.01)，但不影響曠場總路程(t=-0.281，P=0.783)(表6)；2 μg MCT則可明顯增加影響大鼠不動時間(P<0.05)。

表5 不同劑量MCT對大鼠強迫游泳不動時間的影響Tab.5 Effects of different doses of MCT on the immobility time

Ctrl：control；MCT：methoctramine.

圖1 MCT對大鼠強迫游泳不動時間及曠場總路程的影響Fig.1 Effects of MCT on the immobility time and total movement distance

A： effects of 0.5 μg MCT on the immobility time；B：effects of 1 μg MCT on the immobility time；C：effects of 2 μg MCT on the immobility time；D：effects of 1 μg MCT on the total movement distance；*P<0.05；**P<0.01；NS：not significant；Ctrl：control；MCT：methoctramine.

Group Number of case Total movement distanceCtrl 712 796.61±7 662.71MCT 1 μg1013 880.98±7 945.42

Ctrl：control；MCT：Methoctramine.

3 討論

近年來，東莨菪堿的快速抗抑郁治療效果已被多項臨床研究證實，但其作用機制至今仍不清楚。作為M受體的非選擇性拮抗劑，東莨菪堿與M1～M55種M受體亞型均可結合，如能找到介導東莨菪堿抗抑郁作用的具體靶點，將對于研發快速起效抗抑郁藥具有重要意義。

本研究結果顯示：①腹腔注射東莨菪堿能夠減少正常大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間，表明其具有抗抑郁樣的行為學效應；②利用Muscimol沉默mPFC神經元后，東莨菪堿的抗抑郁效應被阻斷，證實mPFC可能是其作用腦區；③一定劑量的M2受體選擇性拮抗劑也具有明顯的抗抑郁樣行為學效應，提示M2可能是東莨菪堿抗抑郁的靶點之一。

以往研究[10-11]表明，PFC是與抑郁癥發病密切相關的腦區，應激可引起PFC神經元萎縮和突觸丟失，從而導致神經元之間功能連接下降。抑郁癥患者表現出PFC灰質體積減少以及血流改變。而通過增強PFC突觸可塑性可發揮抗抑郁作用，如N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA) 拮抗劑氯胺酮，能夠迅速增加PFC細胞外谷氨酸濃度，繼而激活雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 信號通路增強PFC的突觸功能，產生快速抗抑郁作用[12]。Muscimol是GABA-A受體激動劑，通過激活GABA受體可沉默靶區的神經元，本實驗通過在腹腔注射東莨菪堿前先在mPFC腦區給予Muscimol，阻斷東莨菪堿的作用，證明東莨菪堿抗抑郁作用的主要腦區是mPFC。既往的動物實驗[13]也表明，小劑量腹腔注射東莨菪堿可減少動物抑郁樣行為，在mPFC腦區提前注射Muscimol沉默神經元后，東莨菪堿的這一效應被阻斷，本實驗也是進一步驗證這一實驗結果，提示東莨菪堿的抗抑郁樣行為作用可能是通過拮抗mPFC腦區的M受體起效的。

在東莨菪堿的作用靶點研究方面，Witkin等[14]發現敲除M1、M2基因的小鼠再給予東莨菪堿腹腔注射后，東莨菪堿減少強迫游泳不動時間的效應被阻斷；M2受體拮抗劑SCH226206腹腔注射后也可改善動物抑郁樣行為，且敲除M2受體可導致其行為學效應消失。另一種M2受體拮抗劑Gallamine可減少動物強迫游泳不動時間，并在小劑量情況下此種效應成劑量依賴[15]。這些實驗證實了東莨菪堿的抗抑郁作用很有可能由M1、M2受體介導。

本研究發現MCT 1 μg側腦室給藥24 h后可改善大鼠抑郁樣行為。以往也有研究[16]顯示MCT側腦室注射12 h后可減少抑郁模型大鼠強迫游泳不動時間，其行為學效應和東莨菪堿相似，其機制與調節PFC和海馬的激酶A(protein kinase A，PKA)通路從而增強突觸可塑性相關。M2受體在皮質中主要分布于谷氨酸能神經元突觸前終扣以及突觸后GABA能神經元[17-18]。研究[13-19]顯示腹腔注射25 μg/kg或mPFC注射100 pg東莨菪堿可快速改善大鼠強迫游泳實驗中的絕望行為，其機制是東莨菪堿能夠迅速增加大鼠mPFC神經元胞外的谷氨酸水平，使mPFC的mTOR蛋白及其下游核糖體S6激酶磷酸化水平增加，激活mTORC1信號。結合上述研究結果，筆者推測MCT可能通過拮抗GABA能神經元上的M2受體，減少抑制性神經遞質釋放，去抑制地引起錐體細胞興奮性增加，激活mTOR通路，增加突觸的發生和提高突觸可塑性而起到抗抑郁作用。

與此同時，本研究發現相對高劑量的2 μg MCT能夠導致抑郁樣行為增加，以往也有研究發現高劑量的東莨菪堿同樣能夠引發抑郁樣行為，其機制是通過提高乙酰膽堿酯酶活性，降低環磷腺苷效應元件結合蛋白、細胞外調節蛋白激酶、蛋白激酶B的磷酸化水平[20-21]，繼而降低海馬和PFC的腦源性神經營養因子和神經肽而引發動物抑郁樣行為[22]。高劑量的MCT在導致抑郁方面可能也涉及相似的機制，因此，對M2受體阻斷的程度不同可能產生不同的行為學作用。

有研究[23]顯示M2受體激動劑carbachol和physostigmine在高劑量時引起動物抑郁樣行為增加，而低劑量時減少抑郁樣行為，這些實驗表明M2受體的激動或抑制均與動物抑郁樣行為表現有關，而且與作用其受體的藥物劑量也相關。由此可見，M2受體與抑郁癥及抗抑郁治療的關系非常復雜，值得深入研究。本研究不足之處在于只觀察了東莨菪堿和M2受體拮抗劑對大鼠抑郁樣行為的影響的基本現象，其相關機制研究有待進一步開展，另外，其他M受體亞型在東莨菪堿抗抑郁中的作用也需要進一步探討。但本次實驗結果對于快速抗抑郁藥的研發具有指導意義。