α-突觸核蛋白在小膠質細胞炎性反應和吞噬功能中的作用研究

宮曉麗 劉夢茹 王 樂 劉 玚 張 婷 孫 英 王曉民2，*

(1.首都醫科大學基礎醫學院免疫學系，北京 100069；2. 首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069；3. 首都醫科大學教育部神經變性病重點實驗室，北京 100069；4. 首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系，北京 100069)

小膠質細胞是中樞神經系統中唯一的固有免疫細胞，當受到感染、毒物、致病蛋白等因素刺激后會發生炎性反應激活釋放大量促炎因子。除了炎性作用之外，小膠質還有一種重要的功能：吞噬作用。小膠質細胞可以通過吞噬作用清理細胞碎片、清除異常蛋白。小膠質細胞的吞噬功能近年來被認定為是引起細胞死亡的一種方式[1]，在中樞神經系統發育、突觸修剪和突觸重塑上扮演著至關重要的作用[2-3]，并且研究[4-7]提示，小膠質細胞吞噬功能的異常與帕金森病、精神分裂癥、阿爾茲海默病、孤獨癥、疼痛等許多神經系統性疾病存在著密切的關系。

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)是一種由140個氨基酸組成的可溶性蛋白質，主要表達在中樞神經系統突觸前膜，該蛋白在脂質體轉運[8]、神經遞質釋放、突觸可塑性、多巴胺的合成與轉運等方面都發揮著重要的功能[9]。α-syn被認定為路易小體和膠質細胞包涵體的主要組成成分，可溶性α-syn單體會發生異常積聚形成寡聚體，進而形成毒性的纖維體。并且α-syn的毒性作用不僅只作用于神經元，還可以作用于鄰近的小膠質細胞等。

在中樞神經系統中，α-syn單體可激活小膠質細胞，增加細胞吞噬能力和炎性反應因子的釋放，該蛋白的含量異常引起的小膠質細胞的病理激活可能是相關疾病發病的原因之一。目前已有離體研究[10]顯示α-syn對于小膠質細胞炎性激活的作用，在小膠質細胞系過表達α-syn能夠增加腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6) 以及一氧化氮(nitric oxide，NO)的釋放。但α-syn單體對小膠質細胞吞噬功能的影響并沒有得到足夠的重視。本研究應用原代培養的小鼠小膠質細胞，觀察α-syn單體對小膠質細胞吞噬功能以及溶酶體大小的影響，并進一步對比α-syn單體對小膠質細胞炎性反應因子表達的影響，試圖揭示α-syn激活小膠質細胞的主要作用，希望揭示中樞神經系統中α-syn作用于小膠質細胞的主要途徑和作用形式。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J野生型出生24 h內乳鼠繁殖于首都醫科大學動物部，由1只雄性和2只雌性成年小鼠合籠同居交配繁育得到，實驗動物許可證號：SYXK(京)2018-0002。取P0乳鼠全腦(除小腦)的原代混合膠質細胞培養，或振搖獲得原代小膠質細胞進行實驗。本實驗符合中華人民共和國動物保護法，并通過首都醫科大學動物倫理委員會的批準。實驗中按照替代、減少和優化的三項原則，盡量減少動物使用數量和降低動物的痛苦。

1.2 主要試劑

單體α-syn重組蛋白，購自美國rPeptide公司；細菌脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS)購自美國Sigma公司；DMEM-F12培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Hyclone公司；分化抗原68(clusters of differentiation 68，CD68)抗體購自英國AbD Serotec公司；鈣離子結合適配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)抗體購自日本Wako公司；實時定量PCR試劑盒購自美國New England Biolabs公司。

1.3 主要儀器

CO2恒溫培養箱購自美國Thermo 公司；生物安全柜購自美國Thermo公司；共聚焦顯微鏡TCS SP8購自德國 Leica 公司；NanoDrop 2000微量分光光度計購自美國Thermo公司；QuantStudio 5 實時定量PCR儀購自美國ABI公司；Vortex-T 旋渦混合器購自美國Scientific industries公司；SpectraMax Paradigm多功能酶標儀(I3)購自美國Molecular Devices公司。

1.4 原代細胞的提取與培養

剝離出新生24 h內的乳鼠的全腦(除小腦)，在體式顯微鏡下剝除腦膜和血管后，接種于6孔細胞培養板，得到混合培養的膠質細胞體系，培養7 d后可用于實驗；將細胞懸液接種于多聚賴氨酸預包被的75 cm2培養瓶中，放置于 37 ℃、5%(體積分數)CO2的孵箱中培養，每2天進行半量換液，在培養第14天將細胞培養瓶固定于37 ℃ 恒溫搖床，180 r/min恒溫震蕩2 h，獲得原代小膠質細胞。

1.5 細胞模型制備及分組

取得的原代小膠質細胞按1×104的數量接種于細胞玻片上，按處理不同分為：對照組(control)、0.1、1、10 μmol/L α-syn和0.1 μg/mL LPS處理組，加入藥物后作用24 h，并在培養基中加入帶有紅色和綠色的熒光示蹤劑的超純聚苯乙烯微球體用于熒光微球吞噬實驗；分為對照組(control)、1 μmol/L α-syn和0.1 μg/mL LPS處理組，加入藥物后作用24 h，用于CD68蛋白的表達檢測實驗。將混合培養的膠質細胞體系按照2 mL/孔，種于6孔培養板，分為對照組(control)、1 μmol/L α-syn和0.1 μg/mL LPS處理組，加入藥物后作用24 h，提取細胞總RNA和細胞上清用于小膠質細胞炎性激活的檢測。

1.6 免疫熒光和熒光微球吞噬實驗

細胞爬片固定、打孔和封閉處理后加入一抗anti-Iba1(1∶500)和anti-CD68(1∶500)，分別加入Alexa 594 羊抗兔IgG抗體和Alexa 488羊抗鼠IgG抗體二抗避光室溫孵育1 h，Hoechst 33258染料室溫孵育5 min染細胞核；熒光封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。熒光微球吞噬實驗是在加入處理藥物孵育22 h后，每孔加入1 μm大小的熒光微球繼續培養2 h。固定后Hoechst 33258染料室溫孵育5 min染細胞核，熒光封片劑封片，共聚焦顯微鏡下明場微分干涉反差(differential interference contrast，DIC)確定單個細胞形態和輪廓，計數單個細胞內熒光微球的數量。

1.7 實時定量(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction， RT-qPCR)檢測TNF-α和IL-1β的轉錄

RNA提?。?孔培養板中細胞用RNA快速提取試劑(Trizol)，室溫裂解后將裂解液移入1.5 mL 無RNA酶的離心管中，加入三氯甲烷抽提出細胞總RNA，用異丙醇將RNA進行沉淀；漂洗后室溫進行干燥后，用20 μL DEPC水在56 ℃ 溶解RNA，-80 ℃ 保存。按照試劑盒說明書步驟進行RT-qPCR反應，總體系為20 μL，置于QuantStudio 5 實時定量PCR儀中按反應條件擴增。

1.8 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測TNF-α蛋白

收集加藥處理后的細胞上清液進行ELISA測定；先在預包被的孔板中加入 50 μL的稀釋液，再分別加入50 μL的標準品或樣本，室溫反應2 h；用洗滌液洗板5次，拍干；在反應孔中加入100 μL鼠TNF-α/IL-1β 結合試劑，室溫孵育2 h；用洗滌液洗板5次；反應孔中加入100 μL 工作液，室溫避光反應30 min；反應孔中加入100 μL 終止液，測量450 nm的各孔吸光度值。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 α-syn激活小膠質細胞吞噬功能

為了檢測α-syn對細胞的吞噬能力的影響，對各處理組細胞內的磁珠進行示蹤定位和計數。結果顯示，不同濃度α-syn均能增加小膠質細胞對1 μm熒光微球的吞噬數量，并且呈劑量依賴性。與對照組(6.900±0.690)相比，0.1 μmol/L α-syn處理組(13.250±1.115)增加了0.92倍(P=0.041 6); 1 μmol/L α-syn組(18.000±1.459)增加了1.6倍(P=0.000 2)，10 μmol/L α-syn組(21.360±1.889)增加了2.1倍(P<0.000 1)；陽性對照(41.000±4.546)LPS組增加了4.94倍(P<0.000 1)，差異有統計學意義。α-syn能夠刺激小膠質細胞吞噬功能增加且與LPS效果相近。詳見圖1。

2.2 α-syn增加CD68蛋白的表達

通過CD68染色標記小膠質細胞溶酶體，在α-syn或LPS刺激后，CD68表達強度分別顯著增加了 (3.198 0±0.408 4)倍和 (2.930 0±0.673 1)倍，差異有統計學意義(P分別為0.025 0和0.041 8)，代表吞噬功能的增強，詳見圖2。

圖1 α-syn可以誘導小膠質細胞吞噬增加Fig.1 Phagocytosis of microglia increased after α-syn treatment

A： Representative image of a microglia that phagocytosed microspheres， blue indicates Hoechst staining and outer layers of microglia are outlined via the merged image with DIC；scalebar: 10 μm;B： The number of microspheres taken up per cell was counted， with 6-10 cells per groups. Microglia were treated with different concentrations of α-syn and LPS， and the number of microspheres that ingested in cells was counted. Data were analyzed by one-way ANOVA test.*P<0.05，***P<0.001vscontrol;α-syn： α-synuclein;LPS： lipopolysaccharides;DIC：differential interference contrast.

2.3 α-syn對于小膠質細胞炎性的激活

LPS刺激24 h后TNF-α蛋白的釋放增加到(612.5±228.3) 倍，差異有統計學意義(P=0.005 8)，而各濃度α-syn處理組雖然隨劑量有增加趨勢，但增加量遠低于LPS組，10 μmol/L α-syn組增加了(10.15±3.882)倍；隨后選取1 μmol/L α-syn和LPS刺激原代培養的混合膠質細胞24 h后，提取細胞總RNA用于檢測炎性反應因子的轉錄水平。RT-qPCR結果顯示，α-syn可以使TNF-α轉錄水平增加了(1.917±0.162 5) 倍(P=0.005 9)，IL-1β轉錄水平增加(2.937±0.568 1)倍(P=0.034 4)，然而LPS可以使TNF-α和IL-1β增加(33.80±5.883)倍(P=0.005 1)和(308.3±103.9)倍(P=0.041 7)，差異均有統計學意義，詳見圖3。

圖2 α-syn可以增加CD68蛋白的表達Fig.2 Expression of CD68 was increased by α-syn

A： Immunofluorescence of CD68 protein (green) in primary microglia and blue indicates Hoechst staining；Scale bar：25 μm；B： Quantification of the mean fluorescence intensity of CD68 in microglia. 1 μmol/L α-syn or 0.1 μg/mL LPS was added in primary cultured microglia for 24 h. Data were analyzed by one-way ANOVA test.*P<0.05，**P<0.01vscontrol;α-syn： α-synuclein;LPS： lipopolysaccharides;CD68： clusters of differentiation 68.

圖3 α-syn可以誘導小膠質細胞產生炎性激活Fig.3 Expression of pro-inflammatory factors increased by α-syn

Primary microglia-astrocyte mixed culture prepared from the P0 mice and treated with or without α-syn or LPS. The release of TNF-α (A) in mixed microglia supernatant were detected by ELISA. mRNA level of TNF-α(B) and IL-1β (C) were detected by RT-qPCR. Data were analyzed by one-way ANOVA test.*P<0.05，**P<0.01vscontrol;α-syn： α-synuclein;LPS： lipopolysaccharides;TNF-α： tumor necrosis factor-α;IL-1β： interleukin-1 beta;GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay;RT-qPCR:reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction.

3 討論

小膠質細胞激活后會具有兩種最主要的功能：吞噬和炎性反應，也是很多神經系統退變性疾病的兩種重要危險因素。小膠質細胞的炎性反應激活存在于多種中樞神經系統疾病，并且對于疾病的病理發生和進程有著促進作用。被激活的小膠質細胞會分泌出大量的促炎因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、過氧化物、一氧化氮等[11]，給予小膠質細胞LPS刺激便可以迅速誘導細胞TNF-α和IL-1β的生成增多[12-13]，小膠質細胞表現出神經毒性。但吞噬在中樞神經系統中的作用是利是弊一直存在爭議，小膠質細胞的吞噬作用在清除細胞殘片和神經元的突觸可塑性上發揮著十分重要的作用[14]。本研究中選擇LPS作為陽性對照藥物，LPS是一種常用于激活小膠質細胞的工具藥物，其動物模型在中樞神經系統研究中被認為是小膠質細胞激活的經典模型。側腦室注射或全身注射LPS可誘導中樞神經系統中小膠質細胞的激活，并伴有神經元丟失[15-17]。體外研究[18-19]同樣證實，LPS同樣能誘導小膠質細胞的迅速激活，釋放炎性因子，啟動下游MAPK等通路。給予原代小膠質細胞或BV2細胞系細胞LPS刺激后，檢測到小膠質細胞吞噬功能的增加[20]，包括對神經元的吞噬。因此筆者選擇了LPS作為可以明確病理性激活小膠質細胞炎性和吞噬功能的陽性藥物，對比觀察α-syn蛋白在炎性和吞噬兩種功能上對小膠質細胞的激活程度。

本研究對比觀察了帕金森病關鍵致病蛋白α-syn對于小膠質細胞炎性反應和吞噬功能的影響，結果顯示，0.1～10 μmol/L劑量的α-syn能夠顯著升高原代小膠質細胞對于熒光微球的吞噬數量，按照劑量分別升高了0.92、1.62和3.10倍，0.1 μg/mL 的LPS刺激組增加了4.94倍，Park 等[21]在小膠質細胞細胞系BV2和原代大鼠小膠質細胞分別加入1 μmol/L α-syn，作用12 h發現細胞對熒光微球吞噬數分別增加了2倍和1.7倍，Labuzek等[22]用1 μg/mL LPS刺激原代大鼠小膠質細胞24 h，細胞吞噬相對于對照組增加約4倍，結果均與本報道一致。溶酶體作為細胞的消化器官，參與吞噬的整個過程中，應用CD68分子來標記溶酶體，可以反映細胞吞噬功能的變化[23-24]。為了進一步驗證α-syn小膠質細胞吞噬功能的影響，通過CD68染色標記小膠質細胞溶酶體，免疫熒光染色結果提示，1 μmol/L的α-syn能夠使小膠質細胞的CD68蛋白平均熒光強度增加2.2倍，高于LPS組的1.9倍。在炎性激活方面，他們發現在0.1、1、10 μmol/L劑量的α-syn刺激后24 h，細胞上清中釋放的TNF-α增加了0.34、1.1和9.15倍，遠低于LPS處理組的增加倍數(約611.5倍)。Hee課題組[25]給予原代小膠質細胞1、5和10 μmol/L劑量的α-syn刺激24 h，TNF-α蛋白釋放量分別增加約2、7和10倍，與本結果相一致。RT-qPCR結果顯示，1 μmol/L的α-syn使TNF-α和IL-1β轉錄水平分別增加0.9和1.9倍，然而LPS可以使TNF-α和IL-1β分別增加33.8倍和308.3倍。

以上結果提示，α-syn對于小膠質細胞吞噬功能的激活作用要高于對于炎性反應的激活。Neher 等[26]的研究發現，原代培養混合細胞體系中小膠質細胞的吞噬作用會主動誘導健康的神經元死亡，也就是說吞噬作用可能是神經元死亡的原因而不是后果，并且炎性反應在這一過程中扮演著重要的角色。因此本研究提示，α-syn主要是通過激活小膠質細胞的吞噬然后引起神經元被吞噬死亡，來產生致病效果。