重度宮腔粘連相關基因的生物信息學分析

柳 鑫 段 華 成九梅 陳 芳 徐 倩

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科微創中心， 北京 100006)

子宮內膜是由多種細胞成分組成的組織，子宮內膜經過重復的循環過程，包括增生、蛻膜化、剝脫與修復。如果子宮內膜在上述生理過程被干擾或破壞，尤其子宮內膜基底層如被感染或機械損傷，會發生宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)[1]。宮腔粘連形成后會導致月經量減少、流產、胎盤置入等不良結局，進而嚴重影響人類生殖健康。目前，針對重度宮腔粘連性疾病尚沒有能夠改善生育功能和月經生理的有效治療方案。近年來應用芯片技術篩查組織及細胞中mRNA表達譜、驗證及鑒定其靶基因并進一步研究其生物學功能的實驗方法得到廣泛應用。本研究進行了重度宮腔粘連組織的mRNA表達譜芯片分析，找到了與正常子宮組織相比差異表達的mRNA，聯合生物信息學分析工具和數據庫，從分子水平探討宮腔粘連的發生機制，為明確宮腔粘連發生、發展的分子生物學機制提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 標本來源及處理

IUA組：重度宮腔粘連組織13例，均選自年齡30～40歲、月經周期處于增生早期的重度宮腔粘連患者。于宮腔鏡下宮腔粘連分離術中切除粘連組織，剪去周圍有電損傷的部分，約5 mm3大小，于液氮中保存。對照組：正常子宮組織13例，均選自年齡40～45歲、月經周期處于增生早期的子宮肌瘤患者。于子宮全切術后留取正常子宮組織，包括子宮內膜及部分子宮淺肌層組織，約5 mm3大小，于液氮罐中保存。所有患者無其他基礎疾病，術前未用藥物治療。經醫院倫理委員會同意備案，簽署知情同意書。

1.2 RNA提取與芯片實驗

組織中RNA的提取：取出樣品解凍標本，按照Trizol一步法提取總RNA，每個樣品吸取 1 μL，用分光光度計測定RNA 溶液在 260 nm 和 280 nm 下的吸光度值，檢測 RNA 的濃度和純度。吸光度值260 nm/280 nm值在 1.9～2.1之間時，可認為RNA 的純度較好，備實驗用。

芯片實驗：IUA組和對照組各3例標本分別提取總RNA，并行定量、質檢，反轉錄合成cDNA，對每一例標本分別進行Affymetrix Human Gene 1.0芯片(美國Affymetrix公司)分析，共使用6張芯片，包括樣本標記、雜交、洗滌、掃描。獲取重度宮腔粘連組織差異mRNA表達譜。

1.3 統計學方法

1.3.1 差異篩選

在研究兩組樣本差異時，把差異基因作為研究對象，進一步的研究，由于芯片檢測過程中，每組僅有3張芯片，屬于小樣本數據(小于30)，為了減少小樣本造成的差異篩選誤差，利用隨機方差模型修正的t檢驗對兩組進行比較，計算基因間的差異是否有統計學意義，從而得到差異的基因[2]。

1.3.2 差異基因的功能分析(GO-analysis)

GO analysis方法將兩組之間的差異基因基于GO數據庫進行基因功能注釋，得到基因參與的所有功能，而后利用Fisher精確檢驗和多重比較檢驗計算每個功能的差異是否有統計學意義。從而篩選出差異基因所體現的顯著性功能，以P<0.05為差異有統計學意義。

1.3.3 差異基因參與的信號轉導通路分析

基于京都基因與基因組大百科全書數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)，對差異基因利用Fisher精確檢驗和χ2檢驗，把目標基因參與的通路進行顯著性分析，以P<0.05進行篩選，得到顯著性的通路。

2 結果

2.1 RNA質量

臨床組織標本提取總的RNA在3.765～31.62 μg 之間，吸光度值260 nm/280 nm比值在1.87～2.1之間。

2.2 差異基因的篩選

應用6張Affymetrix Human Gene 1.0芯片，比較3例IUA組織與3例對照組正常子宮組織的mRNA表達情況，篩選出1 425個差異基因，其中上調基因731個，下調基因694個。

2.3 差異基因主要的生物學功能

顯著性功能分析結果包括有：信號傳導、多種細胞有機體發育、細胞粘連、細胞分化、單核細胞活化等，詳見表1。

2.4 上調差異基因參與的顯著性信號轉導通路

上調差異基因參與的顯著性信號轉導通路包括Wnt信號通路和黏附連接通路、細胞粘連分子通路、整合素調節通路、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路等，詳見表2。

2.5 下調差異基因參與的顯著性信號轉導通路

下調差異基因參與的顯著性信號轉導通路包括：MAPK信號通路、焦點連接、TGF-b信號通路、縫隙連接等，詳見表3。

2.6 Real-time熒光定量PCR驗證

擴大各組樣本各10例，選取部分目標基因mRNA即：LOX、ADAM9、CDH2、COL16A1應用RT-PCR法進行驗證，研究組與正常組相比，重度宮腔粘連組：LOX下調(0.53±0.06)倍，ADAM9下調(0.67±0.03)倍，CDH2上調(5.19±0.46)倍， COL16A1上調(2.04±0.31)倍。RT-PCR的結果與基因芯片結果表達趨勢一致，IUA組與正常子宮組織相比，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖1。

表1 差異基因主要的生物學功能Tab.1 Main biological function of differently expressed gene

表2 上調差異基因參與的顯著性信號轉導通路Tab.2 Signal pathway of up-regulated gene participating

TGF：transforming growth factor.

3 討論

宮腔粘連是由各種原因導致的子宮內膜纖維化及瘢痕化、不同程度的內膜缺失、內膜變薄、增生及分泌不足、子宮前后壁粘連、宮腔容積縮小等病理改變。重度宮腔粘連的治療依舊是臨床的難點[3-5]。有研究[6]表明宮腔粘連患者子宮肌壁的纖維組織成分占50%～80%，而正常子宮纖維成分僅為13%～20%。子宮瘢痕收縮或宮腔形成粘連造成子宮硬化、宮腔容積縮小及宮腔解剖結構異常，影響子宮月經及妊娠功能。而解決宮腔狹窄、子宮硬化及宮腔異常解剖的關鍵是在細胞生長調控和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)分子水平上闡明如何調控肉芽組織中膠原的合成與分泌，以及如何加速瘢痕中膠原的分解與吸收[7]。經篩選，本課題組得到重度宮腔粘連組織相關基因的主要功能及其所在有顯著差異的通路，并找到部分參與瘢痕修復中膠原沉積及組織重構過程中起作用的基因，據此推斷這些基因參與宮腔粘連形成中的膠原沉積及組織重構，或許可作為治療宮腔粘連的靶標。

表3 下調差異基因參與的顯著性信號轉導通路Tab.3 Signal pathway of down-regulated gene participating

圖1 宮腔粘連組織與正常子宮組織中靶基因表達水平Fig.1 Target gene expression level of IUA and normal uterus tissueA：mRNA gene chip；B：real-time PCR;IUA：intrauterine adhesion；PCR：polymerase chain reaction.

來自美國紐約州立大學的Alimperti等[8]對鈣黏素2亞型(cadherin-2，CDH2)調節的信號對干細胞分化的影響進行了報道。CDH2是一種鈣離子依賴跨膜糖蛋白，是粘連蛋白家族中的一員。在保持細胞與細胞粘連帶中起重要的作用，是與ECM相關的重要的跨膜分子[9-10]。CDH2是上皮間充質轉換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的標志，其效應是產生纖維細胞，來修復由于炎性反應或損傷造成的組織傷害。在生理情況下EMT轉換是靜止的，但當炎性反應激活時，EMT持續存在，最終導致器官纖維化[11]，兩位學者[8]深信對細胞間粘連信號如何影響細胞轉換與分化的研究會幫助研究人員設計特定的生物材料與細胞支架，從而控制干細胞的分化，給組織再生醫學帶來啟示。在本課題組的研究中，宮腔粘連組織中神經元CDH2的表達上調1.6倍(P=0.01)。經生物信息學分析表明可通過細胞粘連分子通路影響CDH2的表達，CDH2是ECM相關的跨膜分子，推斷在宮腔粘連形成中可能存在通過CAM通路調控CDH2從而調節細胞的功能的機制。

德國的學者Gr?ssel等[12]對膠原蛋白16(collagen ⅩⅥ， COL16)與健康和疾病的研究進行了報道。膠原蛋白16是由子宮基質細胞分泌合成的，是微小纖維相關膠原家族中的一員。它可以連接并組成大纖維網絡狀結構調節細胞外基質的完整與穩定。研究[13-14]表明，在生理情況下腸道肌成纖維細胞分泌COL16，當腸道發生炎性反應時，COL16的分泌量增加，并通過焦點連接起來，并會使肌成纖維細胞聚集，進而促進腸道組織發生纖維化反應，在病理狀態下COL16表達的升高會促進炎性反應持續存在。所以COL16在結締組織細胞與細胞外基質相互作用，從而促進創面愈合方面起重要作用[15-16]。在本課題的研究中，相對于正常子宮組織，宮腔粘連組織中COL16A1的表達上調 1.57倍(P=0.019 3)，KEGG分析提示可以通過整合素調節通路調節COL16A1的表達，推斷在宮腔粘連形成中可能存在通過調節整合素信號通路調節COL16A1的機制影響宮腔粘連組織中膠原蛋白含量的表達，從而參與宮腔粘連的發生與發展。

人解整合素樣金屬蛋白酶9(metalloproteinase domaincontaining protein, ADAM-9)屬于跨膜、包含解離素、金屬蛋白酶成員，在細胞-細胞接觸、細胞-基質作用中起一定的作用[17-19]。Mauch等[20]在研究中觀察了ADAM-9蛋白在創傷愈合中所起的作用發現，ADAM-9敲除的動物跟對照組相比，創傷愈合速度加快。本課題組的研究表明在宮腔粘連組織中ADAM-9的表達下調0.58倍(P=0.026)。代謝通路分析提示ADAM-9是TGF-β信號通路中的基因。據此可以推斷宮腔粘連發生發展中存在通過調控TGF-β通路調控ADAM9參與ECM的轉換與重構的機制，調節宮腔粘連的形成。

本研究存在以下局限性：首先樣本量少，研究結果還需基于大樣本的研究的支持。其次，本研究只是初步的分析，還需進行大量系統的研究來驗證這些ECM相關基因通過特定的通路調節參與宮腔粘連發生與發展中的作用機制。這些結果只是初步的研究結果，距離臨床應用還有很長的距離，還需大量系統的研究。利用生物信息學分析能有效挖掘基因芯片數據，而本研究為宮腔粘連發病分子機制的研究提供了新的視野。