T-SPOT.TB,TB-Ab聯合檢測在結核病中的診斷價值

張曉梅 ，夏小明 ，羅興燕 ，胡旺 ，黃鵬 ，3

(1、南昌大學公共衛生學院流行病學教研室，江西 南昌 330006；2、江西省上饒市人民醫院檢驗科，江西 上饒 334000；3、江西省預防醫學重點實驗室，江西 南昌330006)

結核病是一個嚴重的公共衛生問題，來自202 個國家和地區的數據顯示，2013年有大約900萬人罹患結核病，150萬人死于該疾病[1]。傳統的抗酸桿菌涂片靈敏度僅有20%～30%，分枝桿菌培養是目前臨床上應用于結核病診斷的金標準，但其需等4～6周時間才能有結果，培養要求較高，培養陽性率偏低，陽性率只有30%～40%[2]。近年新發展起來的結核感染T細胞斑點實驗 （Tuberculous infectin of T cells spot test，T-SPOT.TB) 屬于以 T 細胞介導的細胞免疫應答為基礎的檢測方法，具有敏感性和特異性均較高的特點[3，4]，已在國內外臨床實驗室廣泛應用。抗結核桿菌抗體（TB-Ab）屬于以體液免疫應答為基礎的免疫學診斷方法[5]，該方法簡便快速，結果易于判斷，但是TB-Ab試驗影響因素較多，其敏感性和特異性均較低[6]。鑒于此，本研究擬采用T-SPOT.TB和TB-Ab兩種試驗聯合對疑似結核病患者進行檢測以探討其診斷價值，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2016年7月-2017年5月在我院住院治療的疑似結核病患者257例，按照患者各自最后確診情況，分為結核性疾病組和非結核性疾病組。

1.1.1 結核性疾病組 共142例，其中男84例，女56 例，年齡 18～90 歲，平均年齡（50.12±19.47）歲。該組有肺結核88例，結核性胸膜炎32例，陳舊性支氣管結核4例，腰椎結核5例，腸結核3例，腎結核3例，骨結核2例，附睪結核2例，結核性腦膜炎1例，結核性淋巴結炎1例，結核變態反應性關節炎1例。該組所有結核病病例的診斷均符合國家衛計委發布的 《結核病分類標準 （WS196-2001）》和《肺結核診斷（ws288-2008）》的標準。

1.1.2 非結核性疾病組 共115例，其中男64例，女 49 例，年齡 18～86 歲，平均年齡（57.91±18.02）歲。該組有肺部感染23例，感染性發熱17例，肺部陰影9例，慢阻肺8例，支氣管擴張8例，胸腔積液7例，肺部腫瘤5例，自身免疫性疾病4例，其他病例34例。

1.2 研究方法

1.2.1 T-SPOT.TB的測定及結果判斷 采用酶聯免疫斑點技術(ELISPOT)檢測，試劑盒是上海復星長征醫學科學有限公司提供 （英國牛津原裝進口）。實驗步驟：①采集4-6ml肝素抗凝血樣本，用ficoll試劑密度梯度離心法提取單個核細胞 （PBMs），將提取的PBMs用AIM-V培養液配置成規定密度的細胞懸液。②取4個測試孔分別加入陽性試劑，結核特異性抗原 A（ESAT-6）和抗原 B（CFP-10），空白孔（AIM-V培養液）。將配置好的PBMs細胞懸液分別加入4個測試孔。③將測試孔放入二氧化碳恒溫培養箱培養16～20h。④培養好的測試孔加酶標二抗在2～8℃孵育1h后洗滌，加顯色劑使得測試孔顯色產生斑點。⑤在顯微鏡下根據斑點數判斷結果：空白孔＜5時，A孔或B孔減空白孔斑點數≥6以及空白孔≥6時，A孔或B孔斑點數≥2倍空白孔，結果判讀為陽性；如上述標準不符合且陽性孔正常時則結果判讀為陰性。

1.2.2 TB-Ab的測定及結果判斷 采用斑點免疫膠體金滲濾技術（DIGFA）檢測，試劑盒由上海奧普生物醫藥有限公生產。操作嚴格按試劑盒說明書操作；結核桿菌IgG抗體檢測的結果判斷是：在反應點和質控點均出現紅色斑點判為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析。計數資料的組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T-SPOT.TB和TB-Ab兩種檢測方法的陽性率及其比較 結核性疾病組的T-SPOT.TB和TB-Ab兩種檢測方法的陽性率分別為88.7%，60.6%，非結核性疾病組T-SPOT.TB，TB-Ab的陽性率分別為20.9，23.5%，兩組比較陽性率差異均有統計學意義（均有 P＜0.01）。結果見表 1。

2.2 T-SPOT.TB和TB-Ab兩種檢測方法的單用和聯用的診斷效果 T-SPOT.TB單用靈敏度88.7%、特異度79.1%、陽性預測值84.0%、陰性預測值85.0%、陽性似然比4.240、陰性似然比0.143、診斷符合率84.4%；TB-Ab單用靈敏度60.6%、特異度76.5%、陽性預測值76.1%、陰性預測值61.1%、陽性似然比2.518、陰性似然比0.515、診斷符合率67.7%；兩種方法并聯靈敏度95.8、特異度62.6%、陽性預測值76.0%、陰性預測值92.3%、陽性似然比2.561、陰性似然比0.067、診斷符合率80.9%；兩種方法串聯靈敏度53.5%、特異度93.9%、陽性預測值91.6%、陰性預測值62.1%、陽性似然比8.77、陰性似然比0.495、診斷符合率71.6%。結果見表2。

表1 兩組T-SPOT.TB和TB-Ab檢測的陽性率及其比較[n（%）]

表2 T-SPOT.TB和TB-Ab兩種方法單用及聯合檢測的診斷指標比較

3 討論

快速準確診斷和早期治療是結核病防治的有效措施。傳統的結核病診斷方法均存在一定的缺陷，結核菌素試驗（TST）易受卡介苗和機體免疫力的影響，其特異度、靈敏度較低。作為結核診斷的金標準結核分枝桿菌培養或抗酸染色雖然特異度高但靈敏度低，而且細菌培養耗時很長，給結核病的快速診斷帶來困難。近年來T-SPOT.TB試驗被廣泛用于臨床結核病的診斷。T-SPOT.TB以T細胞介導的細胞免疫應答為基礎的檢測方法，感染結核后體內長期存在抗原特異性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素（IFN-γ）。 實驗中利用分泌靶抗原 6（ESAT-6）和培養分泌蛋白10（CFP 10）兩種結核特異性抗原刺激外周血中結核特異性T淋巴細胞分泌γ-干擾素，結合酶聯免疫斑點技術(即ELISPOT技術)，通過檢測受結核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應T細胞來判斷受試者是否存在結核感染[7，8]。本研究中TSPOT.TB檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比分別為88.7%、79.1%、84.0%、85.0%、4.24、0.143， 與 Han-Yan Xu等研究的基本接近[9]，但低于國內文獻吳桂玲等的報道（陰性似然比除外）[10]，可能與研究的病例來源或數量有關。TB-Ab的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷符合率分別為60.6%、76.5%、76.1%、61.1%、67.7%，與杜巖青等的研究基本一致[11]。

本研究顯示，T-SPOT.TB檢測的各項指標均優于TB-Ab，提示T-SPOT.TB試驗診斷價值高于TB-Ab試驗。其原因為ESAT-6和CFP-l0均來自結核分枝桿菌基因組RDl區域，且僅有結核分枝桿菌復合群存在RDl區，所有的卡介苗和大多數環境分枝桿菌均缺失該區域，因此T-SPOT.TB方法不受卡介苗接種、環境分枝桿菌感染的影響，具有靈敏度高、特異度強等特點[7，12]。而TB-Ab檢測結果影響因素較多，如交叉抗原、免疫復合物、接種卡介苗或曾感染過結核但未發生臨床反應或已鈣化等均可影響檢測結果，靈敏度、特異度低于TSPOT.TB方法[13]。也有文獻報道，堪薩斯分枝桿菌、蘇氏分枝桿菌、海分枝桿菌等環境分枝桿菌中存在ESAT-6和CFP-l0抗原，可導致T-SPOT.TB試驗產生假陽性[9]；本研究中115例非結核病人有24例假陽性，可能與環境分枝桿菌或患者存在潛伏感染有關。

多種診斷方法的聯合使用可提高診斷的價值。本研究中T-SPOT.TB和TB-Ab并聯的靈敏度為95.8%，均高于T-SPOT.TB和TB-Ab單用的靈敏度，排除結核病的能力提高，但特異度降低（62.6%），該結果與文獻報道基本一致[14，15]。 本研究T-SPOT.TB和TB-Ab串聯試驗的特異度為93.9%，確診結核病的能力提高，但靈敏度降低（53.5%），與 Han-Yan Xu 等報道的結果類似[9]，低于Zhang L等的研究[16]。原因可能是Zhang L等的研究采用的是外周血和漿膜腔積液兩種不同標本的T-SPOT.TB的聯合檢測，兩種試驗的靈敏度都很高，致使串聯的靈敏度也較高。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測的各項診斷指標均優于TB-Ab試驗，兩種試驗聯合檢測可以互相彌補不足。在具體工作中，可以根據實際需要選擇并聯或串聯，以達到提高排除疾病或確診疾病能力的目標。