COX-2-PGE2-EP在白藜蘆醇抗結直腸癌中的作用研究

李燕 ，彭芳 ，鐘斌 ，馮李長 ，張羽 ，徐小軍

(1、贛南醫學院第一附屬醫院；2、贛州市人民醫院；3、贛南醫學院，江西 贛州 341000)

結直腸癌(colorectal cancer)是全球第四大癌癥相關死亡原因，每年估計有超過60萬人死于結直腸癌，約占所有癌癥死亡病例的8%[1]。隨著近年來生活方式的改變，我國結直腸癌的發病率不斷上升，2012中國腫瘤登記年報顯示，腫瘤發病的排位中，結直腸癌首次超過胃癌，躍居第2位[2]。

80%的結直腸癌是由腺瘤性息肉演變而來，癌變前有長達10年的良性腫瘤發展階段，該時間窗為結直腸癌的預防和早期診斷提供了有利的時機[3]。白藜蘆醇為蒽醌萜類化合物，諸多醫學研究表明，白藜蘆醇能夠抑制腫瘤發生發展中的多條信號通路，但其機制有待更深入的研究。

環氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成過程的重要限速酶，COX-2在大多數組織中呈誘導性表達，并能被多種刺激因素如炎癥刺激、生長因子、細胞因子和某些癌蛋白等誘導而表達[5-10]，參與炎癥和腫瘤的發生、發展。本文研究COX-2在白藜蘆醇抗結腸癌中的作用及機制，為白藜蘆醇化學預防及輔助治療結腸癌提供理論及實驗依據。

1 材料和方法

1.1 病例資料 收集我院2015年1月-2015年12月結直腸腺癌、腺瘤性息肉和“正常”結腸黏膜標本各50例及HT-29結腸癌細胞。

1.2 實驗材料 一抗兔抗人COX-2多克隆抗體、HT-29結腸癌細胞。

1.3 實驗方法 實驗采用免疫組織化學方法檢測COX-2在結直腸腺癌、腺瘤性息肉和“正常”結腸黏膜標本、HT-29結腸癌細胞及白藜蘆醇培養的HT-29結腸癌細胞中的表達情況。免疫組織化學試劑一抗COX-2多克隆抗體購自福建邁新公司。采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。石蠟切片厚度3微米，60℃烤箱烤片1h；先用梯度二甲苯脫蠟，繼以梯度乙醇水化，再用蒸餾水浸泡5min；用3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內源性過氧化酶的活性，再用PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復，最后自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑 A，室溫孵育20min，PBS沖洗 3次，每次5min，再加入試劑盒中的試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。在鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染，鹽酸酒精分化后用自來水沖洗返藍，脫水，透明，最后用中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照。

免疫組織化學判斷的標準：定位準確，呈棕黃色顆粒為陽性，COX-2陽性定位于細胞漿或細胞膜， 陽性細胞小于10%為 （-），11%-25%為 （+），26%-50%為（++），51%-75%為（+++），76%-100%為（++++）。

2 實驗結果

免疫組織化學方法檢測結直腸腺癌、腺瘤性息肉和“正常”結腸黏膜標本中COX-2蛋白的表達情況(見圖1)：腺癌組陽性35例（陽性率70%）；腺瘤性息肉組陽性10例（陽性率20%）；“正常”結腸黏膜陽性2例（陽性率4%）；HT-29結腸癌細胞表達（陽性率70%）；白藜蘆醇培養的HT-29結腸癌細胞（陽性率50%）。

免疫組織化學結果顯示環氧合酶-2（COX-2）在結腸腺癌中表達明顯高于腺瘤，但在正常黏膜上皮中幾乎不表達，HT-29結腸癌細胞表達高于白藜蘆醇培養的HT-29結腸癌細胞。差別有統計學意義（P＜0.05）。 見圖 1。

圖1 免疫組織化學結果

3 討論

結直腸腺瘤向結直腸癌的逐級發展提示，特定的化學預防可延緩或防止浸潤性結直腸癌的發展。結直腸腺瘤/結直腸癌預防計劃（CAPP2）近期提供的數據顯示，在一項隨機、安慰劑對照試驗中，受試者每天服用600mg阿司匹林并至少持續2年之后，CRC的發病率明顯下降60%[4]。該臨床試驗表明，阿司匹林可以防止結直腸腺瘤及其潛在腫瘤的形成，但長期大劑量服用阿司匹林可能的消化道出血風險限制了其作為化學預防藥物的使用。因此，在天然藥物有效成份中發掘預防和治療結直腸癌的藥物具有重要的研究價值。

白藜蘆醇為蒽醌萜類化合物，主要來源于蓼科植物虎杖的干燥根莖和根，豆科植物花生的種子，葡萄科植物葡萄果實的皮和籽等。Garvin S等[5]在體內實驗研究發現，白藜蘆醇能誘導人乳腺癌細胞凋亡并抑制其血管生成。有資料表明[6]：白藜蘆醇也能促進胃腺癌細胞的凋亡，但其誘導凋亡的機制仍有待研究。最新的研究證實：白藜蘆醇與順鉑、奧沙利鉑聯用可增強后者對結直腸癌的化療效果，減少耐藥的發生；通過抑制脂多糖誘導的NF-κB激活，減少結直腸癌細胞的炎癥反應；抑制結直腸癌細胞增殖與血管生成，促進癌細胞凋亡[7-9]。

目前研究發現，COX-2通過促進PGE2的合成，誘導前致癌物的活化、抑制凋亡、促進腫瘤新生血管的形成、增加腫瘤細胞的浸潤與轉移[11]。PGE2是一種重要的細胞生長調節因子，發揮廣泛的與炎癥和癌癥有關的生物學效應，過表達的COX-2可促進PGE2的合成，進而直接刺激有絲分裂，最終誘導成骨細胞和乳腺上皮細胞的腫瘤發生[12]。PGE2通過與G蛋白偶聯的前列腺素受體（E-prostanoid receptors，EP）結合而發揮生物學效應，EP 有四種亞型，即 EP1、EP2、EP3 及 EP4，它們分布于機體的各種組織和細胞中，它們與PGE2結合后被激活，通過與G蛋白偶聯產生第二信使，將細胞外的信號傳到細胞內，引起一系列的生理或病理效應[13-15]。COX-2/PGE2/EP信號傳導通路在結直腸癌發生發展中的重要作用，本研究發現白藜蘆醇可減少COX-2表達進而顯著抑制腫瘤細胞增殖，為進一步闡明白藜蘆醇抗結腸癌的具體機制提供了理論及實驗依據。