CRP熒光免疫層析定量檢測儀

楊建鵬 高躍明 魏建崇 陳建國 姜海燕,5

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CRP熒光免疫層析定量檢測儀

楊建鵬1,2高躍明1,2魏建崇2,3陳建國2,4姜海燕2,4,5

（1. 福州大學物理與信息工程學院，福州 350108； 2. 福建省醫療器械和醫藥技術重點實驗室，福州 350108； 3. 江夏學院電子信息科學學院，福州 350116； 4. 福州大學電氣工程與自動化學院，福州 350108； 5. 福建省激光精密加工工程技術研究中心，福建 莆田 351100）

本文研制開發一套用于血清C-反應蛋白（CRP）定量檢測的熒光免疫層析試紙檢測設備。運用CMOS圖像傳感器采集熒光試條圖像信息，使用數學形態學方法濾除圖像噪聲，使用Otsu圖像閾值分割算法得到圖像有用信息進而計算得到檢測結果。本文采用多種不同濃度的熒光免疫層析試紙條進行檢測，實驗結果顯示，該CRP熒光免疫層析定量檢測儀的重復性和線性度良好，＜3.4%，擬合優度2＞99%。結論：該檢測儀有著良好的性能，能夠準確檢測CRP的數值。

CRP；熒光免疫層析；圖像

C反應蛋白（C-reactive protein, CRP）是由人體體內的肝臟在應激狀態下生成的蛋白質[1]。當人體發生組織損傷、急性炎癥、細菌性感染、冠心病、惡性腫瘤等情況時，CRP的含量會隨著病情的嚴重而升高[2-5]。由于機體的CRP濃度與炎癥之間存在相關性，因此醫學上將CRP廣泛應用于衡量或監測體內感染、組織損傷以及某些炎癥疾病的發展，尤其是作為心血管疾病預測和愈后評價的標志分子[6]。當人體發生病原菌感染時，由于身體的應激反應而導致CRP發生較大的變化，通過監測CRP的含量，可以達到診斷感染的作用[8]。

傳統CRP檢測采用單向免疫擴散法（SRID）[7-8]、酶聯免疫吸附測定法（ELIS）[9]等方法，但單項免疫擴散法的檢測敏感性較差、在抗原過量時容易出現假陰性，準確性欠佳；酶聯免疫吸附測定法采用酶作為標記物，缺點是酶標記物容易變質、檢測時間較長[2]。

熒光免疫層析方法以熒光標記物作為示蹤劑標記，通過光學儀器檢測待測樣本，直接或間接獲取待測物有用信息，實現對特定物質的定量檢測。本研究針對傳統CRP檢測方法的不足，采用基于圖像處理的熒光免疫層析方法，開發一款用于檢測CRP的熒光免疫層析定量檢測儀。

1 實現方法

1.1 系統總體組成結構及工作原理

在CRP樣本溶液滴入檢測試條后，其與熒光標記物發生特異性反應。經反應后，熒光試條檢測窗口上的檢測帶（T帶）與質控帶（C帶）含有較多的熒光標記物，因此被激發出高強度的熒光強度，而其他區域的熒光標記物較少，所以被激發出的熒光強度較微弱。T帶的熒光強度直接反應了CRP樣本溶液的濃度值，C帶則是對T帶起對照的作用，消除環境等因素的影響。

檢測儀采用圖像式檢測方法，將充分反應后的熒光免疫層析試條放入儀器檢測，在激發光源的照射下發出熒光，通過圖像傳感器采集熒光試條圖像信息，并將其傳輸給圖像處理設備，該設備對熒光試條圖像信息進行處理。

圖像傳感器采用等間隔均勻量化，圖像的灰度值正比于設備光敏單元的輸出信號。因此，將檢測線的灰度值與控制線的灰度值的比值作為特征值/，特征值與待測溶液濃度成正比。計算T帶與C帶灰度值的比值/，將得到的結果與標準刻度曲線進行對比，即可得到CRP樣本溶液的濃度值，達到定量檢測的功能。檢測儀總體組成結構如圖1所示。

圖1 CRP熒光免疫層析定量檢測儀總體組成結構

1.2 硬件系統

本文選用Eu3+螯合劑作為熒光標記物，Eu3+螯合劑熒光光譜中吸收波長范圍較寬，在波長為230～370mm的光線激發下，發射出610nm的熒光信號。考慮熒光標記物的特性，采用TH-UV365T3WA- 3535-B紫外光LED作為激發光源，該光源采用貼片式封裝，燈珠呈半球形，具有顯色性高、穩定性好、體積小、能耗低的特點。

圖像傳感器主要分為CCD圖像傳感器和CMOS圖像傳感器，二者均有各自的優點。CCD圖像傳感器具有靈敏度高、噪點低的優點，但是其存在成本高、功耗高的缺點；CMOS圖像傳感器具有低成本、低功耗以及高整合度的優點，但噪聲性能不及CCD圖像傳感器。綜合成本、成像質量等因素考慮，檢測儀選用華谷動力公司研發設計UF系列的WP- UF500M型號的CMOS圖像傳感器采集圖像，傳感器具有500萬像素，自帶32MB緩存，具有快速穩定的圖像傳輸速度。

檢測儀光路結構采用雙邊斜射式檢測系統，保證激發光源能夠均勻照射熒光免疫層析試條。檢測裝置如圖2所示。裝置由波長為365nm的LED激發光源、CMOS攝像機和透射波長分別為365nm與610nm的濾光片組成，濾光片可以濾除無關波長的光線。激發光源照射在C帶和T帶上，產生波長為610nm的發射光，經過濾波片進入CMOS圖像傳感器，傳輸到圖像處理設備。

圖2 CRP熒光免疫層析檢測儀

1.3 軟件設計

圖像處理設備接收到從試條圖像獲取設備傳過來的熒光試條圖像，對圖像進行處理，處理過程如圖3所示。

圖3 熒光試條圖像處理流程圖

圖像獲取設備在采集圖像信號的過程中因環境等因素會出現噪聲[10]，這些噪聲對檢測結果會造成不利影響，導致出現誤差[11]。因此在圖像分割之前，必須對原始圖像信號進行濾除噪聲的處理。根據圖像特性，本文利用數學形態學方法[12]濾除噪聲，先進行開運算，平滑圖像輪廓，切割細線，去除邊緣毛刺和異常值，磨光圖像外邊界，再進行閉運算，在圖像中連接較短的斷點，添補小間隙，并對圖像的內部邊沿進行平滑。

鑒于試條C帶和T帶分別在試條的兩側，因此對圖像的處理分為左右兩部分，分別采用Otsu閾值分割準則[13]。該算法概述如下：

設圖像的灰度級數為，每個灰度值出現的概率為，閾值將不同的灰度值分成目標A（灰度值為0～）與背景B（灰度值為+1～-1）。

則目標A和背景B的出現的概率分別為

目標A和背景B的灰度均值分別為

圖像總的灰度均值為

目標和背景的類間方差：

因此，最佳判別閾值需滿足

用Otsu閾值分割算法所得的閾值對熒光試條圖像進行分割，得到檢測線和控制線的灰度值，分割效果如圖4所示。

為檢驗分割效果，本文分別使用迭代法與Otsu分割算法對不同濃度的熒光試條圖像進行分割，并使用區域一致性作為分割算法的對比，比較結果見表1。

表1 分割算法的區域一致性

分別采用1.95mg/mL、7.81mg/mL、62.5mg/mL三種試條進行檢測對比。從表1對比中看出，Otsu的區域一致性優于迭代分割算法。

2 實驗及數據分析

2.1 重復性

重復性原則是科學研究最重要的標準之一。一般情況下，科學實驗的研究應當是可重復的，這意味著實驗結果具有客觀性[14]。尤其對于檢測類儀器來說，可重復性原則是衡量其儀器性能的重要指標之一。

分別選取1.95mg/mL、7.81mg/mL、31.25mg/mL、125mg/mL四種濃度的熒光免疫層析試條作為檢測試條。將四種不同濃度的熒光免疫層析試條分別送入CRP熒光免疫層析試條檢測儀檢測。為保證實驗室的可靠性，由同一測試人員在相同環境下用同樣的儀器對同一根待測試條進行5次重復檢測，并將實驗數據記錄下來，見表2。

表中采用變異系數（）作為儀器重復性的評判標準

式中，()表示測試數據的標準差，()表示測試數據的平均值。從表2可以看出，檢測儀的檢測結果值在0～3.35%之間。

表2 CRP熒光試條檢測結果

2.2 線性度

使用最小二乘法對不同濃度CRP溶液的檢測結果進行曲線擬合，擬合結果如圖5所示。

圖5 儀器的檢測結果線性度

線性關系為

=0.0237+0.0572 （9）

式中，表示特征值/；表示待測液濃度，直線擬合優度2＞0.99，實驗表明，在可測范圍內，儀器的線性度良好。

3 結論

CRP作為人體檢測炎癥的標志物，在血液生化檢測中的作用越來越大[15]。本研究克服傳統CRP檢測方法的不足，設計基于圖像處理的熒光免疫層析試條檢測儀。本文詳細闡述了檢測儀檢測裝置的硬件設計與軟件設計。針對熒光試條圖像信號，采用數學形態學濾除噪聲，Otsu閾值分割方法獲取圖像信息，得到定量檢測結果。

實驗結果顯示，本文研制的檢測儀的檢測結果變異系數值小于3.4%，擬合優度大于99%，與德國Qiagen公司研發的ESE檢測儀相比，值無太大差異，而線性擬合優度更高。這表明檢測儀重復性高，線性度好。除此之外，為了能進一步提高檢測系統的便攜性，還可研發一個檢測終端系統，擺脫檢測儀對于PC的依賴，移植檢測系統到終端上，進一步減小儀器的體積。

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The CRP fluorescence immunochromatography quantitative detector

Yang Jianpeng1,2Gao Yueming1,2Wei Jianchong2,3Chen Jianguo2,4Jiang Haiyan2,4,5

(1. College of Physics and Telecommunication Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108; 2. Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology of Fujian Province, Fuzhou 350108; 3. College of electrics and information science, Fujian Jiangxia University, Fuzhou 350116; 4. College of Electrical Engineering and Automation, Fuzhou University, Fuzhou 350108; 5. Precision Machining Engineering Technology Research Center, Putian, Fujian 351100)

In this study, a set of fluorescence immunochromatographic quantitative detector for serum c-reactive protein (CRP) is developed. The image information of fluorescent strips is collected by using CMOS image sensor, and the image noise is filtered out by the method of mathematical morphology. The Otsu threshold segmentation algorithm is used to obtain the information of the image and to calculate the results. In this study, a number of different concentrations of fluorescence immunochromatographic strips are used to detect. The result shows that the CRP fluorescence immunochromatographic detector has good repeatability, and linearity.＜3.4% and fit2＞99%. The detector has good performance and can accurately detect CRP value.

CRP; fluorescence immunochromatography; image

2018-03-07

楊建鵬（1991-），福建省漳州市人，碩士研究生，主要從事醫學檢測與處理的研究工作。

福建省科技重大專項（2014YZ0001）