MTHFR基因多態性與哈薩克族食管癌發病率的關系

陳康，金澄宇，努爾蘭·阿汗

新疆維吾爾自治區人民醫院胸外科，烏魯木齊830000

據統計，食管癌占全球惡性腫瘤發病率的第9位，是最常見的惡性腫瘤之一，具有典型的區域和民族特征[1-2]。食管癌在中國高發，尤其是生活在新疆的哈薩克族尤為突出[3]。相關研究從分子遺傳學上分析食管癌的發生與葉酸的缺乏和代謝障礙有關，葉酸是調節DNA正常甲基化和保持其完整性的重要物質，亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）則是葉酸代謝過程中的關鍵酶[4-6]。C677T和A1298C是MTHFR基因的多態性位點[7]，其突變可導致MTHFR活性降低，影響體內葉酸的代謝，從而可能導致食管癌的發生[8]。本研究分析了MTHFR基因C677T和A1298C多態性與哈薩克族食管癌發病率的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年2月至2017年2月于新疆維吾爾自治區人民醫院接受治療的78例哈薩克族食管癌患者為觀察組。納入標準：①均經病理組織學診斷確診；②均在本地區居住超過5年。排除標準：①近1個月有急慢性感染或自身免疫性疾病者；②合并其他原發性惡性腫瘤者。觀察組中，男49例，女29例；年齡40～63歲，平均（51.02±9.88）歲。同時選取相同民族、地區、居住年限的健康者234例為對照組。對照組中，男149例，女85例；年齡41～63歲，平均（50.82±10.11）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有受試者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 基因多態性檢測

抽取受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。應用基因組DNA小量抽提試劑盒（購自上海生工生物工程有限公司）提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長度多態性技術檢測MTHFR基因[9-10]，MTHFR基因C677T的上游引物為5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，下游引物為 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'；MTHFR基因A1298C的上游引物為5'-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3'，下游引物為5'-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3'。PCR 體系（25 μl）：基因組 DNA（5 μl），10 pmol/μl的上下游引物（各2 μl），2.5 mmol/L 的 1×dNTP（4 μl）、2.5 U/μl Taq酶（含Mg2+，1 μl），10×PCR Buffe（r5 μl），加水補足至25 μl。PCR 擴增條件：95℃ 5 min，94℃ 1 min，60.5℃1 min，72℃ 1 min，共35個循環，最后72℃延伸8 min。將PCR產物用HinfⅠ限制性內切酶進行酶切鑒定，在37℃條件下消化13 h，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳，確定MTHFR基因型。

1.3 膳食調查

采用24 h膳食回顧調查表，對患者的飲食進行嚴格的定量，計算患者的能量、蛋白質、硒、維生素C、維生素E和葉酸的平均攝入量，且同中國營養學會推薦的中國居民膳食營養素參考攝入量（dietary reference intake，DRI）對比計算比率值，比率值=實際攝入量/推薦攝入量×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗分析樣本-是否具有群體代表性；計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR基因 C677 T和 A1298 C多態性檢測

MTHFRC677T基因型可分為野生型CC（173bp）、雜合型CT（173 bp/125 bp/48 bp）和變異型TT（125 bp/48 bp）；MTHFRA1298C基因型可分為野生型AA（56 bp）、雜合型 AC（56 bp/84 bp）和變異型 CC（84 bp）。

2.2 MTHFR C677 T和MTHFR A1298 C基因型分布及等位基因頻率的比較

觀察組與對照組MTHFRC677T基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（χ2=0.271，P=0.873；χ2=0.232，P=0.630）；觀察組與對照組MTHFRA1298C基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（χ2=1.381，P=0.501；χ2=0.000，P=1.000）。說明MTHRFC677T和A1298C基因型頻率均已達到遺傳平衡，具有人群代表性。（表1、表2）

表2 兩組受試者的MTHFR A1298 C基因型分布及等位基因頻率[ n（%）]

2.3 膳食調查結果

觀察組攝入的能量、蛋白質、硒、維生素C、維生素E和葉酸的DRI比率值均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 兩組受試者各種膳食營養素攝入的DRI比率值比較（%，±s）

表3 兩組受試者各種膳食營養素攝入的DRI比率值比較（%，±s）

組別觀察組（n=78）對照組（n=234）t值P值能量70.12±2.24 101.43±1.89-120.782 0.000蛋白質89.22±24.16 102.11±17.43-5.103 0.000鐵硒201.14±60.03 210.44±50.46-1.342 0.181 80.10±12.21 144.06±13.53-37.020 0.000維生素C 30.01±4.13 35.44±5.21-8.367 0.000維生素E 80.81±21.03 90.11±21.74-3.298 0.001葉酸40.24±9.81 88.56±8.94-40.330 0.000

3 討論

食管癌是中國常見的惡性腫瘤之一，其發生原因可能是相關基因突變，導致腫瘤細胞生成并在食管處增殖，嚴重影響了人們的生活水平和生命健康。目前臨床上對食管癌的發病機制尚未完全清楚，因此，尋找食管癌的具體發病原因成為研究的熱點之一[11]。葉酸可為細胞內DNA正常甲基化和核苷酸從頭合成提供甲基基團，但其必須在體內正常細胞中代謝后才可發揮此生物學功能，因此葉酸的缺乏或代謝障礙可能影響細胞DNA的合成及完整性，從而造成DNA在復制過程中突變率升高[12]。在葉酸的代謝過程中，MTHFR是非常關鍵的催化酶，其可以催化5,10-亞甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸，而后者是細胞內通用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸合成的原料之一。研究發現，MTHFR基因具有多態性，其中最常見的是C677T和A1298C多態，MTHFR基因上這2個位點的改變都會使其編碼的酶活性顯著降低，從而影響葉酸的代謝，導致體內葉酸代謝出現障礙[13]。體內的葉酸水平除了受到基因影響，同時也會受到飲食和生活習慣的影響，如蔬菜水果的攝入量、吸煙、飲酒以及熏制肉品的食用等[14]。哈薩克族人生活在新疆北部，生活相對封閉，主要從事牧業勞動，遺傳背景及生活方式較為單一，蔬菜和水果攝入量較少，并常食用熏制馬肉且有飲酒習慣，因此葉酸的攝入量相對較少，從而影響DNA正常甲基化、DNA從頭合成以及DNA修復的正常運轉，容易造成基因突變，誘發食管癌的發生。Hardy-Weinberg遺傳平衡是檢驗樣品是否具有代表性的公認標準[15]，因此本文采用該標準來衡量所選患者是否具有代表性。結果表明，觀察組和對照組受試者MTHFR基因C677T和A1298C分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，證明所選樣本具有代表性，所得結果具有科學的前提。

基因多態性是指在一個生物群體中，同時和經常存在兩種或多種不連續的變異型或基因型或等位基因。本研究中瓊脂糖凝膠電泳實驗結果表明，MTHFRC677T基因型可分為野生型CC（173 bp）、雜合型CT（173 bp/125 bp/48 bp）和變異型TT（125 bp/48 bp）；MTHFRA1298C基因型可分為野生型 AA（56 bp）、雜合型 AC（56 bp/84 bp）和變異型CC（84 bp），表明MTHFR基因具有多態性。

C677T和A1298C是MTHFR基因常見的突變位點，有關研究表明MTHFR基因C677T和A1298C多態性與腫瘤疾病的發生具有一定的相關性[16]。本研究結果顯示，觀察組與對照組MTHFRC677T基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；觀察組和對照組MTHFRA1298C基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。說明MTHFR基因C677T和A1298C多態性與食管癌的發生無關，不是導致食管癌發生的原因，與張力為等[17]和張金芳等[18]的研究結果一致。然而，王秀梅等[19]卻在研究中得出結論，MTHFR基因C677T多態性是哈薩克族食管癌發生的危險因素；劉靜等[20]的一項Meta分析探討了MTHFR基因多態性與中國人群食管癌易感性的關系，結果顯示，中國人群MTHFR基因C677T多態性與食管癌易感性有關，MTHFR基因A1298C多態性與食管癌易感性無關。由此可見，有關MTHFR基因C677T和A1298C多態性與食管癌發病關系的結論差異較大。這可能是因為食管癌發生可能是多基因聯合造成的，需對更多基因進行聯合檢測，也可能是受限于本研究中的樣本量，需要更大的樣本量，才能得出更準確、更具代表性的結果。

食管癌發病率與MTHFR基因C677T和A1298C多態性關系的研究結果雖不盡相同，但均提示與患者的飲食和生活習慣有關。由于腫瘤的發生是多因素長期積累的結果，因此要從患者的飲食和生活習慣方面進行全面考量，對各種致病因素進行系統總結，才能得到相對準確的結果。本研究探討了食管癌患者及健康者攝入的能量、蛋白質、硒、維生素C、維生素E和葉酸水平，結果顯示，觀察組攝入的能量、蛋白質、硒、維生素C、維生素E和葉酸的DRI比率值均明顯低于對照組（P＜0.01）。說明飲食和生活習慣可能與哈薩克族居民食管癌的發生有一定的關系，飲食結構和生活習慣不合理，會導致體內與葉酸代謝相關物質的缺乏，進而導致DNA的合成與完整性遭到破壞，基因突變的概率增加，最終促進食管癌的發生。

綜上所述，MTHFR基因C677T和A1298C多態性與哈薩克族食管癌發病無明顯關系，食管癌的發生可能與哈薩克族居民的飲食和生活習慣有關。因此，臨床上預防食管癌的發生要從飲食和生活習慣上進行控制，同時本研究的樣本量有限，需要進行更大規模的臨床試驗，從而尋找與食管癌關系密切的基因多態性位點。