VEGF誘導致耐受性樹突狀細胞對口腔鱗狀細胞癌患者 T細胞免疫功能的影響

董斌，張兵#，封亞萍，韓彥博，楊新華，于兵兵

1平頂山市口腔醫院頜面外科，河南 平頂山467000

解放軍第一五二中心醫院2腫瘤科，3病理科，河南 平頂山467000

口腔鱗狀細胞癌是中國目前發病率和致死率較高的頭頸部惡性腫瘤之一，浸潤性強，易發生黏膜下擴散和早期血行轉移，預后較差，嚴重影響患者的呼吸、咀嚼、吞咽等正常生理功能以及患者的生命健康[1]。有研究顯示，口腔鱗狀細胞癌的發生、發展涉及多方面的因素，包括吸煙、飲酒、遺傳、環境、微生物感染等因素[2]。目前，對于口腔鱗狀細胞癌，臨床上主要采取以外科手術為基礎，聯合放療、化療、基因治療、靶向治療等的綜合序列治療方案，雖然大大提高了早期口腔鱗狀細胞癌患者的5年生存率，但是對于晚期口腔鱗狀細胞癌患者或復發轉移患者的預后仍然較差[3]，因此，尋找新的治療方向和干預靶點具有十分重要的臨床意義。腫瘤與機體免疫系統的關系一直是醫學界長期研究的重點課題，腫瘤免疫治療、分子靶向治療、免疫檢查點療法等逐漸應用于臨床，并取得良好的治療效果[4]。但是，有研究顯示，免疫治療的臨床療效受限于腫瘤免疫抑制性微環境，腫瘤免疫耐受是腫瘤細胞逃逸機體免疫系統監控的主要機制之一，除了由于腫瘤細胞自身缺乏免疫原性，還與腫瘤細胞分泌多種細胞因子造成腫瘤微環境改變有關[5]。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是目前已知的功能最強的抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC），在調節腫瘤細胞免疫耐受過程中發揮著關鍵作用[6]。腫瘤微環境中存在的多種細胞因子可誘導DC向致耐受性DC分化，而血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）幾乎存在于所有的腫瘤組織內，有研究顯示，VEGF與DC分化密切相關[7]，但是具體的作用機制目前尚不清楚。本研究將鱗狀細胞癌SCC-4細胞株與小鼠骨髓前體細胞共培養，觀察VEGF對DC分化的影響，從而為口腔鱗狀細胞癌免疫治療的研究提供新的思路和臨床依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 受試細胞

人鱗狀細胞癌SCC-4細胞購自American Type Culture Collection公司。

1.2 受試動物

6～8周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別的C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.3 主要試劑

高糖DMEM細胞培養基、RPMI1640細胞培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、鏈霉素-青霉素雙抗均購自美國GIBCO公司，CFSE購自美國Sigma公司，rmGM-CSF、rmIL-6、rmIL-4和mVEGF均購自德國Miltenyi公司，兔抗鼠VEGF多克隆抗體、MIH5單克隆抗體均購自美國Abcam公司，CD11c-APC、CD80-FITC、CD86-PE、CD40-FITC、主要組織相容性復合體Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）-PE、吲哚胺-2，3-雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）-eFluor、程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）-PE和固定破膜試劑盒均購自美國eBioscience公司，IDO1抑制劑-1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）購自美國Selleck公司，VEGF-A（mouse）ELISA試劑盒和IL-12P70（mouse）試劑盒均購自臺灣Abnova公司。

1.4 主要儀器

FACS Vantage SE型流式細胞儀購自美國BD公司，550型iMaker酶標儀購自美國Bio-Rad公司，DI-CJ-2ND超凈工作臺購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司，HERcell 150i型CO2細胞培養箱和NanoDrop ND-1000紫外分光光度計均購自美國Thermo Scientific公司，Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機和各種型號的移液器均購自德國Eppndorf公司，CX41倒置光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，FA系列電子分析天平購自上海光學儀器廠。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞培養將人鱗狀細胞癌SCC-4細胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的高糖DMEM細胞培養基中進行培養，將細胞置于37℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養。24～48 h更換培養液，48 h傳代1次。

1.5.2 制備小鼠骨髓細胞將小鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75%乙醇溶液中10 min；在無菌條件下，取出下肢骨，采用RPMI1640沖洗骨髓腔，制成細胞懸液；用200目濾網過濾后，2500 r/min離心5 min，離心半徑為8 cm，棄除上清液；加入紅細胞裂解液，裂解細胞，靜置2 min，2500 r/min離心5 min，離心半徑為8 cm，棄除上清液；采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次后，收集骨髓細胞備用。

1.5.3 腫瘤微環境中培養DC采用RPMI1640細胞培養基（含10%FBS，30 ng/ml rmGM-CSF，10 ng/ml rmIL-4，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素）重懸小鼠骨髓細胞，調整細胞濃度為1×106/ml。將小鼠骨髓細胞單層加入12孔板中，實驗分為空白對照組（骨髓細胞）、VEGF組（骨髓細胞+20 ng/ml VEGF因子）、共培養組（骨髓細胞+SCC-4細胞）、抗VEGF組（骨髓細胞+SCC-4細胞+50 ng/ml VEGF抗體）。培養5 d后，收集懸浮及半懸浮細胞獲得未成熟DC。

1.5.4 ELISA法將SCC-4細胞以1×106/孔接種至6孔板中，分別培養24、48、72 h后收集上清，2500 r/min離心20 min，離心半徑為8 cm。采用雙抗體夾心ELISA法檢測VEGF含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。按要求依次稀釋標準品和樣品，分別加入酶標包被板中的各檢測孔中，每孔加入100 μl；設空白孔，每孔加入50 μl生物素化抗體工作液，室溫下孵育120 min，棄去液體，洗滌3次，每孔加入100 μl酶結合工作液，室溫下孵育60 min。棄去液體，洗滌3次，每孔加入100 μl顯色液，37℃避光顯色15 min。每孔加入100 μl終止顯色液，15 min內檢測波長為450 nm處的光密度值（optical density，OD），計算平均值。每個實驗重復3次，取平均值。細胞培養上清中IL-12的檢測方法同上所述。

1.5.5 形態學觀察在細胞培養過程中，采用倒置光學顯微鏡觀察細胞的生長狀況以及細胞形態學變化。

1.5.6 流式細胞術采用流式細胞術（flow cytometry，FCM）收集未成熟DC，采用預冷的PBS洗滌3次后，2500 r/min離心20 min，離心半徑為8 cm，棄除上清液；加入500 μl的Binding Buffer重懸細胞，調整未成熟DC細胞至細胞濃度約為1×105/ml；取每管100 μl，加入2 μl的熒光標記抗體，包括DC表面特異性分子CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ以及IDO、PD-L1抗體，室溫下避光孵育15～20 min；2500 r/min離心20 min，離心半徑為8 cm；棄除上清液；加入500 μl的Binding Buffer重懸細胞；上機檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.5.7 同種異體混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction，MLR）分離小鼠脾臟T細胞，調整細胞濃度為5×106/ml。實驗一：T細胞對照組（未成熟DC+T細胞）、VEGF組（未成熟DC+T細胞+20 ng/ml VEGF因子）、腫瘤上清培養組（未成熟DC+T細胞+SCC-4細胞上清）、抗VEGF組（未成熟DC+T細胞+SCC-4細胞上清+50 ng/ml VEGF抗體）；實驗二：空白對照組（RPMI1640細胞培養基）、陰性對照組（T細胞）、T細胞對照組（未成熟DC+T細胞）、抗IDO組（未成熟DC+T細胞+1 mmol/L 1-MT）、抗PD-L1組（未成熟DC+T細胞+1 mg/ml MIH5抗體）、抗IDO+PD-L1組（未成熟DC+T細胞+1 mmol/L 1-MT+1 mg/ml MIH5抗體）。將各組未成熟DC與T細胞（5×105/孔）分別按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的比例單層加入至96孔板中，加入RPMI1640細胞培養基（10%FBS、30 ng/ml rmGM-CSF、10 ng/ml rmIL-4、1000 U/ml IL-2、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素），72 h后，加入20 μl噻 唑 藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT），置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于振動器上振動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結晶物。將96孔板放置于450酶標儀上，檢測波長為450 nm處的OD值，計算平均值。每個實驗重復3次，取平均值。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用隨機區組設計的方差分析和單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCC- 4細胞培養上清中的VEGF水平

ELISA檢測結果顯示，24、48、72 h時SCC-4細胞培養上清中VEGF的相對表達量分別為（181.54±52.67）pg/ml、（329.46± 73.23）pg/ml、（648.74±62.17）pg/ml，3組比較，差異有統計學意義（F=164.250，P＜0.01）。隨著培養時間的延長，VEGF的相對表達量明顯增加，培養72 h后，SCC-4細胞上清中VEGF的相對表達量高于24、48 h時SCC-4細胞上清中VEGF相對表達量，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 體外誘導DC的形態特征和表型特征分析

于400倍倒置光學顯微鏡下觀察DC的形態特征，T細胞對照組小鼠骨髓細胞在rmGM-CSF和rmIL-4的誘導下，呈集落狀分布，體積增大，細胞表面有少量毛刺狀突起，為典型的DC形態，但是VEGF組和共培養組細胞集落形成數量及懸浮DC數目均較對照組明顯減少。提示口腔鱗狀細胞癌微環境及VEGF因子可有效地抑制DC的分化。

與空白對照組比較，VEGF組、共培養組和抗VEGF組DC表面特異性分子CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達水平及細胞培養上清中IL-12的表達水平均有所降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；但是，共培養組和抗VEGF組DC表面特異性分子的表達水平卻均稍高于VEGF組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而抗VEGF組和共培養組DC表面的CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 各組未成熟DC表面標志分子以及培養上清中IL-12表達水平的比較（±s）

表1 各組未成熟DC表面標志分子以及培養上清中IL-12表達水平的比較（±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.05；b與VEGF組比較，P＜0.05

組別空白對照組VEGF組共培養組抗VEGF組F值P值CD11c（%）61.35±3.23 40.79±1.85a 49.21±2.02a b 50.76±1.76a b 135.489 0.000 CD80（%）53.62±0.94 43.19±1.28a 48.81±1.29a b 49.97±1.23a b 126.459 0.000 CD86（%）45.54±0.87 30.89±0.91a 38.74±0.83a b 39.15±1.02a b 434.192 0.000 CD40（%）65.91±2.84 53.17±3.08a 61.52±2.28a b 62.04±2.08a b 42.517 0.000 MHCⅡ（%）29.49±0.75 18.44±0.69a 22.83±0.70a b 22.61±0.83a b 376.548 0.000 IL-12（pg/ml）36.52±0.58 27.72±0.38a 30.33±0.48a b 29.94±0.51a b 588.705 0.000

2.3 各組DC對同種異源 T細胞增殖活性的影響

MLR法檢測結果顯示，未成熟DC能夠輕度刺激T細胞增殖，且隨著未成熟DC與T細胞比例的增加，未成熟DC刺激T細胞增殖的活性逐漸加強。在相同比例下，4組未成熟DC刺激T細胞增殖的活性比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；其中，T細胞對照組和抗VEGF組未成熟DC刺激T細胞的增殖活性均高于VEGF組和共培養組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；且T細胞對照組刺激T細胞的增殖能力高于抗VEGF組，差異有統計學意義（P＜0.05）；VEGF組和共培養組刺激T細胞增殖能力比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同組別未成熟DC誘導后同種異源 T細胞增殖情況的比較（±s）

表2 不同組別未成熟DC誘導后同種異源 T細胞增殖情況的比較（±s）

注：a與T細胞對照組比較，P＜0.05；b與VEGF組比較，P＜0.05；c與共培養組比較，P＜0.05

組別T細胞對照組VEGF組共培養組抗VEGF組F值P值DC∶T細胞1∶5 9.35±0.21 6.48±0.21a 6.39±0.19a 7.19±0.19a b c 491.432 0.000 1∶10 6.15±0.17 3.31±0.18a 3.29±0.17a 4.03±0.14a b c 656.381 0.000 1∶20 2.83±0.19 1.49±0.19a 1.51±0.20a 1.69±0.21a b c 104.337 0.000 1∶50 1.15±0.16 0.41±0.16a 0.39±0.17a 0.53±0.14a b c 51.458 0.000

2.4 VEGF誘導未成熟DC表達IDO和PD-L1

FCM檢測結果顯示，4組未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。與T細胞對照組比較，VEGF組、共培養組和抗VEGF組中未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達水平均有所升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而共培養組未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達水平最高。抗VEGF組未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達水平均低于VEGF組和共培養組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 口腔鱗狀細胞癌微環境中VEGF誘導未成熟DC表達IDO和PD-L1（%，±s）

表3 口腔鱗狀細胞癌微環境中VEGF誘導未成熟DC表達IDO和PD-L1（%，±s）

注：a與T細胞對照組比較，P＜0.05

組別T細胞對照組VEGF組共培養組抗VEGF組F值P值IDO 63.44±5.57 81.42±7.02a 84.37±5.53a 76.81±6.97a 21.750 0.000 PD-L1 49.22±5.51 62.06±7.02a 64.38±6.28a 59.42±6.53a 14.209 0.000

2.5 未成熟DC通過高表達IDO和PD-L1對 T細胞增殖活性的影響

MLR法檢測結果顯示，未成熟DC通過高表達IDO和PD-L1，在相同比例下，各組T細胞增殖活性比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；抗IDO組、抗PD-L1組和抗IDO+PD-L1組T細胞的增殖活性均高于T細胞對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中，抗IDO+PD-L1組T細胞的增殖活性最高。而抗IDO組和抗PD-L1組T細胞的增殖活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表4）

表4 不同組別未成熟DC誘導后 T細胞增殖活性的比較（±s）

表4 不同組別未成熟DC誘導后 T細胞增殖活性的比較（±s）

注：a與T細胞對照組比較，P＜0.05；b與VEGF組比較，P＜0.05；c與共培養組比較，P＜0.05

組別T細胞對照組抗IDO組抗PD-L1組抗IDO+PD-L1組F值P值DC∶T細胞1∶5 5.98±0.34 7.52±0.46a 7.39±0.31a 8.46±0.52a b c 60.331 0.000 1∶10 2.64±0.19 3.87±0.26a 4.01±0.23a 4.53±0.21a b c 127.679 0.000 1∶20 1.42±0.14 1.87±0.11a 1.86±0.16a 2.49±0.08a b c 121.532 0.000 1∶50 0.31±0.04 0.54±0.04a 0.50±0.07a 0.83±0.06a b c 157.827 0.000

3 討論

與其他大多數惡性腫瘤一樣，口腔鱗狀細胞癌的發生涉及多種因素、多個階段的調控，而腫瘤微環境為腫瘤的生長提供了有利條件，但是其中的非腫瘤成分，也參與調控腫瘤的發展和轉歸，包括腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophage，TAM）、髓樣來源抑制細胞、調節性T細胞、致耐受性DC等[8-9]。腫瘤免疫耐受是腫瘤細胞逃逸機體免疫系統監控的主要機制之一，除與腫瘤細胞自身缺乏免疫原性有關外，也與腫瘤微環境中存在的影響免疫狀態的各種細胞因子有關[5]。

DC是目前發現的免疫調節功能最強大的APC，通過有效地識別、處理、呈遞外來抗原，使機體發揮正常的免疫監視功能[10]。正常情況下，未成熟DC能夠識別吞噬抗原，繼而分化為成熟的DC，刺激抗原特異性T細胞發生免疫反應[11]。但在腫瘤微環境中，雖然存在大量的浸潤DC，但是腫瘤細胞依然能夠發生免疫逃逸，這可能與腫瘤微環境中存在的免疫抑制分子有關，如VEGF、IL-2等[12]。本研究將口腔鱗癌細胞株SCC-4作為刺激細胞，將小鼠髓源性DC作為反應細胞，共培養后發現，口腔鱗狀細胞癌中VEGF能夠抑制DC分化，同時抑制T細胞增殖，提示口腔鱗狀細胞癌中VEGF誘導的未成熟DC可能屬于一類致耐受性DC。

未成熟DC在誘導T細胞外周免疫耐受的過程中發揮了重要的作用，但是在腫瘤微環境中誘導未成熟DC產生致耐受性的作用機制尚不明確。本研究首先采用ELISA法證實了SCC-4細胞分泌VEGF的能力，提示可利用SCC-4細胞體外模擬口腔鱗狀細胞癌高表達VEGF的微環境，進一步探討VEGF對未成熟DC的影響。結果顯示，VEGF組、共培養組和抗VEGF組DC表面CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達水平均低于空白對照組。DC在體內分為成熟狀態和未成熟狀態，未成熟DC攝取抗原后，在炎性因子刺激下，將抗原物質降解為抗原肽，經過一系列的修飾加工后，與MHCⅡ分子結合成為穩定的MHC-抗原肽復合物，從而被T細胞特異性識別[13]。由于T細胞對抗原的識別具有MHC限制，因此，MHC分子的表達水平可反映抗原呈遞能力。未成熟DC攝入抗原后，逐漸分化成為成熟DC，細胞表面的CD80、CD86、CD40、MHCⅡ共刺激分子的陽性表達率升高，CD80、CD86、CD40與相應配體結合后可激活細胞表面黏附分子的表達，并誘導IL-12等多種細胞因子的分泌，延長DC壽命[14]。CD-11c屬于小鼠DC表面的標志分子，其表達水平的降低說明腫瘤微環境中VEGF可抑制骨髓前體細胞向DC分化；而CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達水平的降低提示DC仍處于未成熟狀態，抗原呈遞功能受到抑制。

IDO和PD-L1是目前研究較為廣泛的致耐受性分子，主要表達于APC表面，并且與腫瘤的發展密切相關，通過多種調控機制抑制效應T細胞的功能，促使調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）生成，進而導致免疫耐受。有研究顯示，PD-L1可能通過與T細胞表面的CD80結合，抑制晚期T細胞的免疫監視功能[15]。上述研究結果已經證實口腔癌中的DC多為未成熟細胞，且腫瘤微環境中的VEGF可明顯抑制DC分化，因此推測VEGF誘導致耐受性DC可能的作用機制為促使未成熟DC高表達IDO和PD-L1分子。Marti等[16]經研究認為VEGF可促使成熟DC高表達IDO，進而抑制T細胞的免疫反應。本研究采用FCM證實IDO和PD-L1在未成熟DC表面表達水平較高，拮抗VEGF的表達后，IDO和PD-L1的表達水平下調，說明口腔鱗狀細胞癌微環境中VEGF可促使未成熟DC表達IDO和PD-L1，從而致誘導耐受性DC的生成。

綜上所述，口腔鱗狀細胞癌微環境中大量的VEGF分子通過刺激IDO和PD-L1的表達，可抑制未成熟DC向成熟DC分化，從而誘導致耐受性DC的形成，并進一步抑制T細胞的增殖，干擾機體對腫瘤細胞的免疫監控，產生免疫耐受，促進口腔鱗狀細胞癌的發展。