microRNA-200 a在惡性肝臟腫瘤患者血液及腫瘤組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

王勇，代榮陽

1西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州646000

2自貢市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 自貢643020

肝癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤之一，中國肝癌的發(fā)病率和病死率均居世界前列[1]。該病好發(fā)于40歲以上男性，進(jìn)展緩慢，患者早期易忽視，其典型癥狀為肝區(qū)增大脹痛、消瘦，后續(xù)易引發(fā)電解質(zhì)紊亂、重要器官轉(zhuǎn)移以及惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)等，重者可危及生命[2-3]。microRNA是一種非參與編碼的小RNA，可調(diào)控機(jī)體細(xì)胞的分化以及增殖，故其水平與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。microRNA-200a作為microRNA家族的重要成員之一，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄后翻譯過程[6]。既往研究顯示，其在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)呈下調(diào)狀態(tài)[7-8]；同樣，有文獻(xiàn)顯示，其在多種惡性腫瘤患者血液中的表達(dá)亦呈下調(diào)狀態(tài)[9]。而目前對血液和腫瘤組織中microRNA-200a表達(dá)與惡性肝臟腫瘤患者預(yù)后關(guān)系方面的深入研究較少，其在預(yù)測惡性肝臟腫瘤患者預(yù)后方面的價(jià)值尚未得到充分認(rèn)證。因此，本研究旨在觀察microRNA-200a在惡性肝臟腫瘤患者腫瘤組織和血液中的表達(dá)，探討其在預(yù)測惡性肝臟腫瘤方面的臨床意義，為microRNA-200a廣泛應(yīng)用于惡性肝臟腫瘤患者篩查提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2009年1月至2011年1月就診于自貢市第三人民醫(yī)院肝膽外科并行肝癌完整切除術(shù)的惡性肝臟腫瘤患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者肝臟腫瘤為原發(fā)性且無轉(zhuǎn)移；②術(shù)前患者肝功能Child-Pugh分級為A～B級，保肝治療評為A級后接受手術(shù)；③經(jīng)影像學(xué)診斷腫瘤無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④患者接受肝癌根治術(shù)，肝臟切除量均在70%內(nèi)，術(shù)后標(biāo)本均被確診為肝細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后合并重度感染；②合并急性心衰、心源性休克及其他重要臟器疾病。共納入79例患者作為肝癌組，其中男58例，女21例；年齡41～70歲，平均年齡（55.14±8.68）歲，收集其肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織及血液樣本。癌旁組織取自距離肝癌組織2 cm組織，正常肝臟組織取自距離肝癌組織3～5 cm組織。另外，選擇無肝膽原發(fā)疾病或影響肝功能的其他疾病且無腫瘤的83例患者為對照組，其中男性49例，女性34例；年齡39～73歲，平均（52.74±10.62）歲。兩組患者年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑RNA提取試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自保齡寶生物股份有限公司，實(shí)時(shí)PCR試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2.2 肝臟腫瘤患者血樣采集及組織microRNA提取 所有患者入院后晨起空腹抽取靜脈血8 ml，于4℃5000×g條件下離心15 min，-100℃條件下保存血清。利用試劑盒提取總microRNA，并保存于-100℃條件下待檢。分別收集肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織總體microRNA，并將A260/A280比值控制在1.8～2.1。

1.2.3 microRNA反轉(zhuǎn)錄 取反轉(zhuǎn)錄體系20 μl，并于37℃條件下反應(yīng)1 h，95℃條件下反應(yīng)5 min，而后將體系于-20℃條件下保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增與定量 取擴(kuò)增體系25 μl，于95℃預(yù)變性15 min后，94℃、15 s，55℃、30 s，70℃、30 s條件下擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。所有待檢測樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，利用公式△△Ct=試驗(yàn)組（Ct樣本-Ct對照）-對照組（Ct樣本-Ct對照），得出microRNA-200a在肝癌細(xì)胞及肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)量，而后對惡性肝臟腫瘤患者血清、腫瘤組織及癌旁組織中的microRNA-200a相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

比較惡性肝臟腫瘤患者與對照組血液標(biāo)本中microRNA-200a相對表達(dá)量；同時(shí)分析肝癌患者體內(nèi)肝癌組織和癌旁組織中microRNA-200a相對表達(dá)量。

1.4 腫瘤患者術(shù)后處理及隨訪

肝臟腫瘤患者術(shù)后均給予胃腸減壓、腹腔引流。術(shù)后給予靜脈滴注白蛋白20 g，3～5天。密切監(jiān)測患者血常規(guī)、肝腎功能等情況。術(shù)后5天根據(jù)B超情況拔除腹腔引流管，其他均對癥處理。

對參與研究的79例腫瘤患者進(jìn)行為期5年的隨訪，首次隨訪時(shí)間為治療結(jié)束3個(gè)月后，之后每隔3個(gè)月門診復(fù)查或電話隨訪一次。終點(diǎn)事件：患者自入選時(shí)間起于隨訪期間因惡性肝臟腫瘤及并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。原始資料參照患者入院記錄，并將末次隨訪記錄作為隨訪結(jié)果，記錄患者發(fā)病年齡、性別、肝炎及肝硬化病史、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平、腫瘤大小、分化程度、是否轉(zhuǎn)移及TNM分期等。刪失定義為患者失訪、拒絕訪問、中途退出、死于其他與研究無關(guān)的原因。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制ROC曲線，通過約登指數(shù)確定診斷切點(diǎn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清microRNA-200 a相對表達(dá)量的比較

肝癌組患者血清microRNA-200a相對表達(dá)量為（4.61±1.28），明顯低于對照組的（6.20±0.78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.599，P=0.000）。

2.2 肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織microR-NA-200 a相對表達(dá)量的比較

惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織的microRNA-200a相對表達(dá)量分別為（0.67±0.18）、（1.68±0.27）、（2.88±0.36），組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.242，P=0.000）。

2.3 不同臨床特征肝癌患者腫瘤組織及血清中microRNA-200 a相對表達(dá)量的比較

高中分化及未發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織中microRNA-200a相對表達(dá)量均明顯高于低分化及發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.882、6.245，P＜0.01）；不同性別、年齡、肝炎或肝硬化病史、AFP水平、腫瘤直徑及TNM分期患者肝癌組織中microRNA-200a相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AFP水平≤8.1 ng/L、高中分化、未發(fā)生轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的惡性肝臟腫瘤患者血清中microRNA-200a相對表達(dá)量均明顯高于AFP水平＞8.1 ng/L、低分化、發(fā)生轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.097、5.481、4.899、3.317，P＜0.01）；不同年齡、性別、肝炎或肝硬化病史、腫瘤直徑患者血清中microRNA-200a相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.4 microRNA-200 a相對表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系

對79例肝癌患者進(jìn)行隨訪，共失訪5例，死亡31例，死亡率為41.9%。根據(jù)患者結(jié)局情況分為死亡組和生存組。死亡組患者肝癌組織microRNA-200a相對表達(dá)量為（0.58±0.17），明顯低于生存組的（0.72±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.878，P=0.000）。根據(jù)兩組患者肝癌組織microRNA-200a相對表達(dá)量構(gòu)建預(yù)測患者結(jié)局的ROC曲線，得到AUC=0.824，最佳診斷切點(diǎn)為0.625，此時(shí)敏感度為0.791，特異度為0.645（圖1）。根據(jù)約登指數(shù)確定的切點(diǎn)0.625，將肝癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。其中，高表達(dá)組48例，失訪3例，死亡11例；低表達(dá)組31例，失訪2例，死亡20例。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，高表達(dá)組患者生存情況明顯優(yōu)于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.090，P=0.000）（圖 2）。

表1 不同臨床特征肝癌患者腫瘤組織及血清中microRNA-200 a的相對表達(dá)量（ n=79）

圖1 肝癌組織microRNA-200 a相對表達(dá)量預(yù)測肝癌患者（ n=79）結(jié)局的ROC曲線

圖2 microRNA-200 a高表達(dá)（ n=48）與低表達(dá)（ n=31）肝癌患者的生存曲線

3 討論

肝癌作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，好發(fā)于中年男性，發(fā)病后除肝區(qū)增大脹痛、消瘦等臨床經(jīng)典表現(xiàn)外[10]，亦可引發(fā)惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)等[11]，甚至威脅患者的生命[12]。有文獻(xiàn)表示，microRNA在調(diào)控機(jī)體細(xì)胞的分化、增殖方面作用明顯，故其水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。microRNA-200a作為microRNA家族的重要成員之一，既往文獻(xiàn)提示，其在多種惡性腫瘤患者組織及血清中的表達(dá)均呈下調(diào)狀態(tài)，而目前對血清和腫瘤組織中microRNA-200a表達(dá)與惡性肝臟腫瘤患者預(yù)后方面的深入研究較少，為提高惡性肝臟腫瘤切除率，降低其風(fēng)險(xiǎn)，延長患者預(yù)期壽命并提高生存質(zhì)量，對于microRNA-200a在惡性肝臟腫瘤患者腫瘤組織和血液中表達(dá)的研究已然成為現(xiàn)階段臨床工作的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一[15]。本研究回顧性分析了79例行肝臟腫瘤切除術(shù)患者的病歷資料，并分別收集其肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織及血液樣本，并選取另外排除肝膽疾病的83例患者作為對照組，比較兩組患者血清microRNA-200a相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，惡性肝臟腫瘤患者microRNA-200a相對表達(dá)量明顯低于對照組，這一結(jié)果提示microRNA-200a可能具有抑制腫瘤生長的作用，但仍需進(jìn)一步研究。

進(jìn)一步比較惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織microRNA-200a相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，正常肝臟組織microRNA-200a相對表達(dá)量高于癌旁組織，而癌旁組織microRNA-200a相對表達(dá)量高于肝癌組織。也有研究分析microRNA-200a下調(diào)在肝癌組織中較正常組織明顯[16]，本研究與報(bào)道結(jié)果基本一致。

進(jìn)一步比較患者臨床特征與肝癌組織及血清中microRNA-200a相對表達(dá)量關(guān)系結(jié)果提示：高中分化及未發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織中microRNA-200a相對表達(dá)量均明顯高于低分化及發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，AFP水平≤8.1 ng/L、高中分化、未發(fā)生轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的惡性肝臟腫瘤患者血清中microRNA-200a相對表達(dá)量均明顯高于AFP水平＞8.1 ng/L、低分化、發(fā)生轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者。這一結(jié)果進(jìn)一步提示了microRNA-200a可能具有抑制肝臟惡性腫瘤生長的作用。不同TNM分期及AFP水平的患者microRNA-200a相對表達(dá)量在血清中存在差異，而在腫瘤組織中差異不顯著，這可能與microRNA-200a不僅在腫瘤中表達(dá)有關(guān)[17]。

比較肝癌死亡組與生存組的microRNA-200a相對表達(dá)量，可見生存組的相對表達(dá)量明顯高于死亡組，根據(jù)ROC曲線確定的診斷切點(diǎn)將患者分為microRNA-200a高表達(dá)組和低表達(dá)組，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，microRNA-200a高表達(dá)組生存情況明顯優(yōu)于microRNA-200a低表達(dá)組，更加證明了microRNA-200a表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，但對于microRNA-200a與患者預(yù)后相關(guān)性的作用機(jī)制目前仍未確定。

同時(shí)，本研究尚存在不足，研究對象較少，納入臨床特征種類較少。本研究僅能證明microRNA-200a與肝癌患者預(yù)后存在一定的關(guān)系，但對于兩者因果關(guān)系的判斷還需要進(jìn)一步證明。

通過本研究證明，惡性肝臟腫瘤患者血清中microRNA-200a相對表達(dá)量明顯低于對照組正常患者；microRNA-200a在惡性肝臟腫瘤組織相對表達(dá)量較癌旁組織、正常肝臟組織明顯減低；microRNA-200a表達(dá)與肝癌患者預(yù)后有關(guān)，并且microRNA-200a表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越好。