survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌組織中的表達及與胰腺癌患者臨床特征的關系

趙甦，崔衛東，宋偉華

鄭州大學第五附屬醫院肝膽胰腺外科，鄭州 450052

胰腺癌的總體生存預后較差，流行病學研究顯示，胰腺癌的病死率可達25%以上[1]。現階段臨床上胰腺癌的診斷水平較低，其早期篩查的靈敏度及特異度均不理想。腫瘤細胞生物學特征的改變是促進胰腺癌早期發生的重要因素。存活蛋白（survivin）能夠通過影響腫瘤細胞的增殖速度和浸潤能力，促進胰腺導管上皮細胞早期核異型性的發生，導致腫瘤細胞轉移的風險增加[2-3]。胱天蛋白酶3（caspase 3）是凋亡相關因子家族成員，可以抑制腫瘤細胞程序性凋亡，促進腫瘤細胞增殖，提高G1/S期細胞比例[4-5]。有研究揭示了caspase 3和survivin在泌尿系統惡性腫瘤發生中的作用，認為高表達的caspase 3和survivin是促進腫瘤進展的重要因素[6]，但在胰腺癌中的研究不足。本研究采用免疫組織化學法分析caspase 3和survivin在胰腺癌組織中的表達情況，并分析其與胰腺癌患者臨床特征的關系，旨在為胰腺癌的血清學診斷提供新的參考指標，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2012年3月至2017年3月于鄭州大學第五附屬醫院行手術切除的胰腺癌患者的臨床資料。納入標準：①術前未合并其他部位惡性腫瘤；②術后病理證實為胰腺癌；③手術根治性切除腫瘤，術后生存期大于1個月，未發生圍術期并發癥；④有完整規范的術后病理報告及隨訪資料；⑤術前未接受放化療。排除標準：①合并其他系統嚴重疾病者；②未能完成隨訪者；③合并貧血及凝血功能障礙者；④合并風濕及免疫系統疾病者；⑤合并嚴重的肝腎疾病者；⑥合并甲狀腺功能障礙者；⑦因其他部位腫瘤進行過放化療者。根據納入和排除標準，本研究共納入180例胰腺癌患者，收集患者的胰腺癌組織標本180例及對應的癌旁組織（距離病灶邊緣3～5 cm）標本90例。180例胰腺癌患者中，男95例，女85例；年齡32～79歲，平均（60.1±13.2）歲；分化程度：高分化73例，中低分化107例；有淋巴結轉移86例，無淋巴結轉移94例；TNM分期：I期53例，Ⅱ期41例，Ⅲ期46例，Ⅳ期40例。

1.2 免疫組織化學染色法

所有組織標本均經石蠟包埋后作連續切片，厚度約為4 mm，采用鏈霉卵白素-生物素法染色，二氨基聯苯胺（diamionben zidene，DAB）顯色。survivin和caspase 3蛋白抗體、PV6000通用型二抗以及SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術開發公司。以陽性片和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗分別作為陽性和陰性對照，高倍顯微鏡下觀察survivin和caspase 3的表達情況，具體染色步驟嚴格按照SP試劑盒說明書進行操作。

1.3 免疫組織化學染色結果判定

每例標本在400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數每個視野中100個腫瘤細胞中的陽性細胞數，取其平均數計算陽性細胞所占百分比。根據染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞所占百分比≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分。根據染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分之和判斷免疫組織化學染色結果，0分為陰性（－），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。所有病理切片均由兩位高年資病理醫師進行單盲法評估。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件-對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織中survivin、caspase 3蛋白陽性表達率的比較

survivin陽性顆粒呈棕色，主要位于細胞質及細胞核；caspase 3陽性顆粒呈淡黃色或棕黃色，主要位于細胞質（圖1）。胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達率為86.67%（156/180），明顯高于癌旁組織的 34.44%（31/90），差異有統計學意義（χ2=76.855，P＜0.01）（表 1）。胰腺癌組織的 caspase 3蛋白陽性表達率為88.33%（159/180），明顯高于癌旁組織的36.67%（33/90），差異有統計學意義（χ2=77.966，P＜0.01）（表2）。

圖1 survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達情況（免疫組化染色，×400）

表1 胰腺癌組織和癌旁組織中survivin蛋白的表達情況

表2 胰腺癌組織和癌旁組織中caspase 3蛋白的表達情況

2.2 胰腺癌組織中survivin和caspase 3蛋白表達與胰腺癌患者臨床特征的關系

有淋巴結轉移、中低分化胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達率均高于無淋巴結轉移、高分化患者，差異均有統計學意義（χ2=5.758，P=0.016；χ2=5.532，P=0.019）；不同年齡、性別、TNM分期胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。高分化胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達率明顯高于中低分化患者，差異有統計學意義（χ2=6.805，P=0.009）；不同年齡、性別、TNM分期、淋巴結轉移情況胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表 3）

表3 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中survivin和caspase 3蛋白的表達情況（n=180）

3 討論

胰腺癌的發病原因較為復雜，一般認為基因水平或者消化酶的波動可能是促進胰腺癌發生的主要原因。近年來越來越多的研究顯示，基因調控或者分子生物學水平的改變是促進胰腺癌發生的又一重要因素。腫瘤相關蛋白能夠影響腫瘤細胞的生物學特征，增強對腫瘤細胞細胞周期的調控，促進免疫逃逸，抑制機體的T淋巴細胞免疫反應，進而協助腫瘤浸潤或轉移[7]。血清學指標在惡性腫瘤特別是消化系統惡性腫瘤的早期篩查及臨床預后評估中具有重要的參考價值，本研究的目的是為臨床上胰腺癌的篩查提供新的研究靶點，并為胰腺癌患者的預后預測提供參考。

survivin蛋白作為核轉錄因子家族成員，包含了多個巰基蛋白結構，能夠通過結合胰腺癌干細胞，促進干細胞對于鄰近正常組織的浸潤能力；同時survivin蛋白對Notch或AKT信號通路具有激活作用，導致移行上皮細胞核分裂象的異常，腫瘤細胞對基底膜層的突破作用明顯增加[8-9]。caspase 3蛋白不僅可以影響胰腺癌細胞的凋亡水平，同時還能夠促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，影響腫瘤細胞的細胞周期調控，或者在促進惡性腫瘤的免疫逃逸等方面發揮一定的作用[10-11]。

本研究結果顯示，在胰腺癌患者的胰腺癌組織及癌旁組織中，均可以發現survivin和caspase 3蛋白的陽性表達，提示二者均可能參與胰腺癌的疾病進展，二者的陽性表達能夠促進腫瘤細胞生物學特性的改變和上皮間質轉化，影響基底膜的完整性，進而影響胰腺癌的發生過程。本研究結果顯示，胰腺癌組織中survivin和caspase 3蛋白的陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P＜0.01），提示survivin和caspase 3蛋白可能在促進腫瘤細胞浸潤的過程中發揮了重要作用。此外，本研究結果還顯示，有淋巴結轉移、中低分化胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達率均高于無淋巴結轉移、高分化患者（P＜0.05），這主要考慮與survivin蛋白對于淋巴結內皮黏附分子adherin的表達調控作用有關，但具體機制仍需要后續研究的進一步探討；高分化胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達率明顯高于中低分化患者（P＜0.01），不同淋巴結轉移情況胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示caspase 3蛋白不會影響腫瘤細胞的遠處轉移。同時還可以發現，不同TNM分期胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin和caspase 3蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。分析原因可能是caspase 3和survivin蛋白主要影響胰腺癌的早期發生過程，而對于后續臨床分期的進展可能影響不大。

綜上所述，survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌組織中高表達，并且與腫瘤的發生發展關系密切。