ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在結直腸癌中的表達及意義

楊學民，李朝路，李兆陽

1北京市石景山醫院普外科，北京 100043

2中國醫科大學實驗動物部，沈陽 110001

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在發達國家發病率居第2位，在中國發病率及病死率呈上升趨勢[1-3]。雖然診斷、手術技術不斷發展，但是結直腸癌侵襲轉移仍是患者術后復發甚至死亡的主要原因[1-2]。結直腸癌等惡性腫瘤的侵襲轉移是一個多基因、多步驟、多種信號通路參與的復雜過程，涉及細胞的增殖、黏附、遷移、侵襲轉移等過程[1-2]。細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是一種常見的白細胞分化抗原，能夠介導淋巴細胞與腫瘤細胞的黏附，使腫瘤細胞局部附著形成轉移灶，促進腫瘤細胞的浸潤轉移[4]?；|金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）能夠介導細胞外基質的降解，為腫瘤細胞的浸潤擴散提供充足條件[5]。上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）通過介導細胞間的同質黏附，使細胞間黏附降低，促進腫瘤細胞脫落進入淋巴循環，最終發生擴散[6]。因此探討ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在結直腸癌發生發展過程中的作用，有助于了解結直腸癌侵襲轉移的相關機制，為結直腸癌患者的診斷、預后判斷提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取2013年1月至2017年10月于北京市石景山醫院手術切除的68例經病理檢查確診為結直腸癌患者的結直腸癌組織，其中男48例，女20例；年齡41～78歲，中位年齡59.5歲，＜55歲21例，≥55歲47例；分化程度：高分化21例，中分化17例，低分化30例；腫瘤大?。海?.0 cm 50例，≥5.0 cm 18例；Dukes分期：A期14例，B期13例，C期25例，D期16例；有淋巴結轉移41例，無淋巴結轉移27例。另外選取對應的距離結直腸癌組織＞5 cm的68例正常組織作為對照。所有患者在術前均未接受過任何化療、放療及生物治療等。

1.2 主要試劑及材料

兔抗人ICAM-1、MMP-9及E-cadherin多克隆抗體均購自美國Abcam公司，DAB顯色試劑盒、SP法免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 免疫組化法檢測ICAM-1、MMP-9及E-cadherin表達情況

組織標本經福爾馬林固定后，石蠟標本包埋并連續切成4 μm厚度的切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后用枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復，接著根據免疫組化試劑盒采用SP法對石蠟標本進行一抗、二抗孵育，并染色，最后在光鏡下觀察蛋白的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷

ICAM-1及E-cadherin主要表達于細胞膜，當細胞膜上出現棕黃色或棕褐色顆粒說明陽性表達；MMP-9主要表達于細胞質，當細胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒說明陽性表達。在高倍鏡下隨機選取一張切片中的5個視野進行觀察，并采用雙盲法對染色的細胞進行觀察計數。根據細胞的著色程度進行評分：未染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據陽性細胞占視野細胞總數的百分比進行評分：無陽性細胞為0分，＜25%為1分，≥25%且＜50%為2分，≥50%且＜75%為3分，≥75%為4分。二者評分乘積：0分為陰性（－），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），≥9分為強陽性（+++）。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達

ICAM-1在結直腸癌組織中的陽性表達率為75.00%（51/68），明顯高于癌旁正常組織的10.29%（7/68），MMP-9在結直腸癌組織中的陽性表達率為77.94%（53/68），明顯高于癌旁正常組織的22.06%（15/68），E-cadherin在結直腸癌組織中的陽性表達率為32.35%（22/68），明顯低于癌旁正常組織的92.65%（63/68），差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在68例結直腸癌患者的結直腸癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達情況比較[n（%）]

2.2 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin陽性表達與結直腸癌臨床特征的關系

C+D期、有淋巴結轉移及低分化的結直腸癌患者ICAM-1、MMP-9陽性表達率均明顯高于A+B期、無淋巴結轉移及高中分化的結直腸癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）；C+D期、有淋巴結轉移及低分化的結直腸癌患者E-cadherin陽性表達率均明顯低于A+B期、無淋巴結轉移及高中分化的結直腸癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位結直腸癌組織中ICAM-1、MMP-9及E-cadherin陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 結直腸癌組織中ICAM-1、MMP-9及E-cadherin表達的相關性

經Spearman相關性分析，結直腸癌組織中ICAM-1與MMP-9表達呈顯著正相關（r=0.839，P＜0.01），ICAM-1與E-cadherin表達呈顯著負相關（r=-0.597，P＜0.01），MMP-9與E-cadherin表達呈顯著負相關（r=-0.896，P＜0.01）。

3 討論

ICAM-1是一種與細胞黏附、遷移及抗原呈遞密切相關的介導分子，在正常情況下，僅少量的ICAM-1表達于淋巴細胞、內皮細胞等細胞表面，而在腫瘤環境下，ICAM-1被大量分泌，參與腫瘤的發生發展[4]。研究顯示，ICAM-1基因多態性與結直腸癌的發生發展密切相關[7]。李艷等[8]采用免疫組化法比較了結直腸癌原發病灶、非癌正常組織、結直腸腺瘤組織中ICAM-1的表達，結果表明ICAM-1在非癌正常組織、腺瘤組織及癌組織中陽性表達率依次升高，差異有統計學意義，同時結直腸癌中ICAM-1的表達與Dukes分期及淋巴結轉移密切相關，而不與年齡、性別、腫瘤部位等相關。本研究也采用免疫組化SP法檢測了68例結直腸癌組織及相應的癌旁正常組織中ICAM-1的表達，結果與李艷等[8]研究結果一致，結直腸癌組織中ICAM-1陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，同時C+D期、有淋巴結轉移及低分化的結直腸癌患者ICAM-1陽性表達率均明顯高于A+B期、無淋巴結轉移及高中分化的結直腸癌患者，提示惡性程度高的結直腸癌細胞分泌大量的ICAM-1，通過其配體分子促使結直腸癌細胞與淋巴細胞黏附，并局部附著，進而隨著淋巴細胞循環進入血液形成轉移灶。

表2 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin陽性表達與結直腸癌臨床特征的關系（n=68）

MMP-9是MMP中分子量最大的一種水解酶，主要是由細胞與細胞間質間的淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等分泌形成。MMP-9能夠水解細胞的基底膜和細胞外基質，促進細胞穿過基底膜向鄰近組織擴散侵襲，同時還能夠促使內皮細胞穿過基底膜并向遠處遷移，形成血管，為腫瘤細胞的生長侵襲提供足夠的營養物質與空間[5]。本研究采用免疫組化法測定了68例結直腸癌組織及癌旁正常組織中的MMP-9表達，結果表明結直腸癌組織中MMP-9陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，同時C+D期、有淋巴結轉移及低分化的結直腸癌患者MMP-9陽性表達率均明顯高于A+B期、無淋巴結轉移及高中分化的結直腸癌患者，與多數學者研究結果一致[5,9-10]。而Nikolaeva等[11]研究表明結直腸癌組織中MMP-9陽性表達與淋巴結轉移、分化程度及TNM分期無關，與本研究結果不一致，可能源于實驗條件的差異、樣本量的大小不同等。本研究結果說明高表達的MMP-9為結直腸癌細胞的惡性生長、浸潤轉移提供了更加充足的空間與營養基礎。

E-cadherin是一種介導上皮細胞間黏附，維持細胞極性與分化形態的跨膜蛋白，在腫瘤細胞中，E-cadherin大部分呈現表達量下調或者缺失，致使細胞間黏附減弱，細胞上皮形態發生變化，最終導致腫瘤細胞侵襲轉移[6]。本研究免疫組化結果表明，結直腸癌組織中E-cadherin陽性表達率均明顯低于癌旁正常組織，同時C+D期、有淋巴結轉移及低分化的結直腸癌患者E-cadherin陽性表達率均明顯低于A+B期、無淋巴結轉移及高中分化的結直腸癌患者，與E-cadherin在大多數腫瘤組織中的表達趨勢一致[6]。另外秦樂和曾妍[12]研究還證實了E-cadherin的表達缺失與結直腸癌患者的預后不良密切相關。提示E-cadherin的低表達甚至缺失使結腸癌細胞間的黏附發生了障礙，減弱了結直腸癌細胞間的相互作用，促進了結直腸癌細胞的浸潤轉移。

同時本研究經Spearman相關性分析得出結直腸癌組織中ICAM-1與MMP-9表達呈顯著正相關，ICAM-1與E-cadherin表達呈顯著負相關，MMP-9與E-cadherin表達呈顯著負相關。另外研究表明胃癌組織中ICAM-1與MMP-9表達呈正相關[13]，食管癌血清中E-cadherin與ICAM-1表達呈負相關[14]，腎上腺皮質腫瘤組織中MMP-9與E-cadherin表達呈負相關[15]。進而提示高表達的ICAM-1、MMP-9，低表達的E-cadherin共同促進結直腸癌的發生及浸潤轉移。

綜上所述，結直腸癌組織中ICAM-1、MMP-9高表達，E-cadherin低表達，三者與結直腸癌的分化程度、Dukes分期及淋巴結轉移有關，說明三者的聯合檢測對結直腸癌惡性程度及侵襲轉移能力的判斷具有一定的指導意義。