刺五加內生放線菌Streptomyces sp. CWJ-256次生代謝產物研究

王新位，郭文強，趙建元，余利巖，席楠，何寧，王珊珊，袁麗杰，解云英

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刺五加內生放線菌CWJ-256次生代謝產物研究

王新位，郭文強，趙建元，余利巖，席楠，何寧，王珊珊，袁麗杰，解云英

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所（王新位、郭文強、趙建元、余利巖、席楠、何寧、王珊珊、解云英）；063000 唐山，華北理工大學基礎醫學院/河北省慢性疾病重點實驗室/唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室（袁麗杰）

研究刺五加植物內生放線菌 CWJ-256 次級代謝產物及其生物活性。

采用 16S rRNA 基因同源進化分析對菌株 CWJ-256 進行初步分類鑒定，采用抗菌活性追蹤方式，對 CWJ-256 發酵液通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、薄層色譜顯色以及高效液相色譜等方法對目標化合物分離純化，利用核磁共振波譜法和質譜法鑒定化合物的結構。采用 MTT 法測試其抗腫瘤細胞增殖活性。基于Gluc 報告系統對化合物3 的體外抗流感病毒藥效學進行初步評價。

菌種鑒定顯示CWJ-256 為生黑孢鏈霉菌；從該菌株的發酵代謝產物中分離得到 3 個活性化合物，經結構鑒定為efomycin G（化合物 1）、11,11'-O,O-dimethylelaiophylin（化合物 2）、elaiophylin（化合物 3）；抗腫瘤細胞增殖活性評價顯示，化合物1 和3 對體外培養的人乳腺癌細胞 MDA-MB-231 具有增殖抑制作用（IC50分別為4.385 和2.118 μmol/L）。體外抗流感病毒藥效學評價顯示，化合物3 對流感病毒A/WSN/33(H1N1) 具有一定抑制效果。

刺五加內生放線菌CWJ-256 可產生多個洋橄欖葉素類次生代謝產物，顯示出抗細胞增殖、抗病毒等多種活性。

刺五加△； 內生放線菌； 洋橄欖葉素； 抗腫瘤活性； 抗流感病毒活性

植物內生菌（endophytes）是一類部分或整個生活史都在健康植物組織細胞內或細胞間，并且不會造成植物明顯的致病癥狀的微生物，包括細菌、放線菌、真菌[1]。由于這些微生物生活在植物組織內部，而植物并沒有明顯的外在感染癥狀，所以內生菌的存在和作用長期以來被忽視。直至 20 世紀 30 年代，發現造成畜牧業重大損失是由于牲畜食用了感染內生真菌的牧草，才開始對內生菌的深入研究[1]，研究表明內生菌代謝產物有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用。有學者從歐洲紅豆杉中分離到內生真菌 Acremonium sp.，其能產生一系列抗真菌、抗癌的肽類活性物質。研究表明植物內生菌同土壤微生物相比，在發現新的生物活性產物方面具有更大潛力[2]。在以往的研究中，內生菌所涉及的大都是內生真菌，之后才擴展到內生細菌、內生放線菌的范疇[3]。

刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms，來源于五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanax），是一種名貴的藥用植物。刺五加含有能產生抗腫瘤、抗菌等作用的多種有效成分[4]，如胡蘿卜苷、丁香苷等苷類化合物，葡萄糖、阿拉伯糖等多糖和黃酮等具有人參樣藥理功效的成分，還含有香豆素、脂肪酸、揮發油、氨基酸及微量元素等[5]。藥用植物內生放線菌綜合了內生菌、放線菌及藥用植物三方面的特性和優勢，成為尋找新型微生物代謝產物的又一重要資源[6]，而且國內外少見對藥用植物刺五加內生放線菌的研究報道。因此，我們選定本實驗室保存的具有抗金黃色葡萄球菌活性的刺五加內生放線菌株 256 作為研究對象，采用活性追蹤的方式，從其產生的次生代謝產物中分離得到了3 個具有抗菌活性的系列化合物256-2（化合物1）、256-3（化合物2）、256-4（化合物3），經鑒定，結構分別與糖基化大環內酯類抗生素洋橄欖葉素類抗生素 efomycin G、11,11'-O,O-dimethylelaiophylin、elaiophylin 結構相同。三種產物具有良好的抗菌活性，且對體外培養的人乳腺癌細胞 MDA-MB-231 增殖有抑制作用，其中化合物3 對流感病毒A/WSN/33(H1N1) 顯示出一定的抑制活性。

菌株經過鑒定，確定為生黑孢鏈霉菌。本文報道該菌株的菌種鑒定和次生代謝產物的分離純化、結構鑒定、抗乳腺癌細胞 MDA-MB-231 增殖活性、抗流感病毒A/WSN/33(H1N1) 活性以及初步的抗腫瘤活性構效學關系研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 刺五加內生放線菌CWJ-256 分離自藥用植物刺五加，由華北理工大學基礎醫學院袁麗杰教授課題組提供，在本課題組實驗室保存。檢定菌金黃色葡萄球菌（ATCC25923）由中國藥學微生物菌種保藏中心（CPCC）提供。

1.1.2 色譜填料和試劑 丙酮、石油醚、甲醇、氯仿、二氯甲烷均為分析純，購自北京化工廠；色譜級甲醇和乙腈購自迪馬科技有限公司；Chelex-100 Resin 樹脂購自上海美吉生物有限公司；PCR 引物及常規試劑分別購自上海生工生物工程股份有限公司；復合維生素購自美國惠氏制藥有限公司；4006 大孔吸附樹脂購自南開大學精細化學實驗廠；硅膠 GF254（100 ~ 200 目和 200 ~300 目）購自青島海洋化工廠；葡聚糖凝膠 LH-20 購自上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠；分析型色譜柱 Shimadzu ODS-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）購自日本島津公司；半制備型色譜柱 ReproSil-Pur Basic C18 柱（10 mm × 250 mm，5 μm）購自德國 Brueckle 公司。

1.1.4 培養基 斜面培養基 ISP2：酵母浸粉4.0 g/L、葡萄糖 4.0 g/L、麥芽浸粉 10.0 g/L、復合維生素 250 mg/L、微量鹽（FeSO4·7H2O 0.2 g、 MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、去離子水 100 ml）0.5 ml/L、瓊脂 18.0 g/L、去離子水配制，pH 7.2 ~ 7.4，121 ℃高壓滅菌 30 min。發酵培養基：普通淀粉 25 g/L、葡萄糖 5 g/L、蛋白胨 3 g/L、牛肉膏 3g/L、CaCO32.5 g/L、微量元素（FeSO41.0 g、MnCl21.0 g、ZnSO41.0 g、CuSO41.0 g、CoCl21.0 g、蒸餾水 1000 ml）1.0 g/L，自來水配制，pH 7.2，121 ℃高壓滅菌 30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株CWJ-256 的種屬鑒定 16S rRNA 基因擴增 Chelex-100 法提取基因組 DNA。采用通用引物：27f（5' AGAGTTTGATC CTGGCTCAG 3'）和 1525r（5' AGAAAGGAGGTG TACCAGCC 3'）。擴增程序：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 1 min，54 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1.5 min，35 個循環；72 ℃延伸 10 min。PCR 產物經純化由寶生物工程（大連）有限公司測序。將所測序列在 GenBank 做 BLAST 比對，取相似性較高的菌株用 CLUSTAL X 軟件進行多序列比對，用 MEGA2.1 軟件包中的鄰接法（Neighbor-Joining）進行聚類分析，并構建供試菌與參比菌之間的系統進化樹。

1.2.2CWJ-256 發酵 將 8 支于 28 ℃已培養 6 d、生長良好、長滿孢子的CWJ-256 試管斜面（ISP2 培養基）用無菌鐵鏟刮取 1/4 接種于 5 L 三角瓶（含有 1 L 發酵培養基）中，共 32 瓶，于 28 ℃、180 r/min條件下培養 7 d，獲得液體發酵產物。

1.2.3CWJ-256 活性代謝產物初步分離與分析 收集菌株CWJ-256的發酵液（32 L）經 4500 r/min 離心 25 min，棄去上清液。將菌絲體用 1 倍體積的丙酮超聲提取 2 h，過夜浸泡，過濾獲得丙酮提取液，減壓濃縮。再次加入 1 倍體積的丙酮，超聲 1 h 二次提取，得到粗品 6 g。粗品溶解后拌入 2 倍重量硅膠，減壓蒸餾揮去有機試劑，樣品采用干法上樣，減壓硅膠柱層析（硅膠 G 200 ~ 300 目）分離得到 4 個組分。對所得組分進行 HPLC 分析，根據其 HPLC 圖譜及抗菌活性測試結果，確定組分 4 為主要代謝產物以及主要活性組分，液相檢測其最大紫外吸收為 250 nm 左右，且成系列吸收峰。

1.2.4CWJ-256 活性代謝產物的純化 針對組分 4 采用加壓硅膠柱層析（二氯甲烷:甲醇= 15:1）法得到 6 個組分（4-1、4-2、4-3、4-4、4-5 和4-6），對 6 個組分進一步進行HPLC 分析（甲醇-水，梯度 50% ~ 100% ，30 min；流速 1 ml/min；檢測波長250 nm；柱溫箱30 ℃），抗MRSA 活性跟蹤顯示主要活性組分集中于4-5 和4-6。將組分 4-5 和 4-6 合并（1.2 g），采用中壓制備色譜法（甲醇-水，梯度 50% ~ 100%，55 min；流速 10 ml/min；檢測波長245 nm）得到多個流分，再次經 HPLC分析，合并組分31 ~ 35、41 ~ 44 和50 ~ 53。

31 ~ 35 組分流動相溶解后行制備 HPLC，83% 甲醇等度洗脫，流速 4 ml/min，檢測波長 250 nm，得到化合物 1。

本研究受訪者學歷、工作年限、職稱等分布較為均衡，但來自二級及二級以上者較多，而醫院級別影響眼科醫師對指南認知和應用情況，加之調查對象的選擇未采用隨機抽樣的方法，因此結果可能存在偏倚。在本次研究的基礎上，如果相關學會或者政府相關部門牽頭進行全面調查，其結果可能會更準確。

41 ~ 44 組分流動相溶解后行制備 HPLC，85% 甲醇等度洗脫，流速 4 ml/min，檢測波長 250 nm，得到化合物 3。

50 ~ 53 組分流動相溶解后行制備 HPLC，90%甲醇等度洗脫，流速 4 ml/min，檢測波長 250 nm，得到化合物 2。

1.2.5 抗菌活性及抗細胞增殖活性檢測 抗菌活性檢測采用紙片擴散法，具體為：吸取待測液約20 μl，吸附于直徑 5.0 mm 濾紙片，揮干有機試劑，貼附在含有金黃色葡萄球菌檢定菌的平皿表面，37 ℃培養 12 ~ 18 h，觀察抑菌圈有無及大小。抗細胞增殖活性使用 MTT 法測定，將人乳腺癌細胞 MDA-MB-231 接種于 96 孔板，細胞濃度為 5 × 104個/ml，每孔 200 μl，培養 24 h 后加入待測化合物，繼續培養 48 h，加入 MTT 再培養 4 h，然后加入 DMSO 150 μl/孔，于 570 nm 測定吸光度（570），計算增殖抑制率：

增殖抑制率（%）=（1 –試驗孔/對照孔）× 100%

分別測定不同濃度的增殖抑制率，據此確定 IC50（μmol/L）值。每個濃度設 5 孔重復，結果取平均值。

1.2.6 基于 Gluc 報告系統的抗甲型流感病毒活性測定 方法參考文獻[7]：使用293T 衍生系細胞293T-Gluc mono6 細胞鋪96 孔板，每孔接種2.5 × 104個，于100 μl 含10% FBS 的DMEM 培養液中培養。細胞鋪板24 h 后每孔加入1 μl 待測化合物 3（化合物母液濃度為 30 和 10 μmol/L），對照組陽性化合物為利巴韋林，母液濃度120 μmol/L?；衔锛尤? h 后，甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1) 以MOI 0.2 進行病毒感染。24 h 后各取10 μl 檢測上清液中Gluc 蛋白含量，測量結果以相對光單位（RLU）表示，計算所測樣品對甲型流感病毒的抑制率，實驗重復 3 次。

2 結果

2.1 Streptomyces sp. CWJ-256 的種屬鑒定

菌株CWJ-256 的16S rRNA基因序列經過擴增并測序后，得到16S rDNA序列。

在 EzBioCloud 數據庫進行 BLAST，結果表明，其與NBRC 12839T（AB184185）、DSM 40830T（AY508511）、NRRL B-3602T（DQ334781）、NBRC 13061T（AB 184283）、NRRL B-1346T（EF408735）、NBRC 100778T（AB249941）NBRC 100767T（AB249934）、NBRC 101000T（AB249962）的相似性在98.88% ~ 99.70% 之間。運用 CLUSTAL X 軟件進行序列比對并計算實驗菌株與以上參比標準菌株之間的序列相似性。運用 MEGA version 5.0 軟件采用鄰接法構建系統發育樹，其中菌株 256 與標準菌株NBRC 13061T（AB184283）的序列相似度高達 99.70%，聚在同一個進化分支上（圖 1）。由此推斷菌株 256 為。

2.2 化合物 1、2、3 的分離純化和結構鑒定

CWJ-256 發酵培養物菌絲體部分經過兩次等體積丙酮萃取，粗品經過 HPLC 分析后得到紫外吸收相近的系列化合物（圖 2），經過硅膠柱色譜和半制備型 HPLC 分離純化后，得到 3 個化合物 256-2（化合物 1，白色粉末，12.5 mg）、256-3（化合物 2，白色粉末，10.4 mg）、256-4（化合物 3，白色粉末，15.4 mg）。LC-MS 結果顯示，26.0 min（化合物 1）洗脫峰給出 [M+Na]+峰為1033.2，29.9 min（化合物 3）洗脫峰給出 [M+Na]+峰為1047.2，32.8 min（化合物 2）洗脫峰給出 [M+Na]+峰為1075.2。核磁數據顯示，化合物 1 氫譜中給出 43個氫信號，碳譜中給出 27 個碳信號；化合物 2 氫譜共給出 46 個氫信號，碳譜給出 28 個碳信號；化合物 3 氫譜中共給出 44 個氫信號，碳譜給出 27 個碳信號。通過微譜13C-NMR 數據庫檢索并查閱相關文獻[8-12]，對比文獻報道中13C-NMR 圖譜數據，初步推測化合物 1 ~ 3 分別為 efomycin G、11,11'-O,O-dimethyleliophylin、elaiophylin，分子式分別為 C53H86O18、C56H92O18、C54H88O18（圖 3），為洋橄欖葉素類化合物。因該類化合物結構顯示出高度對稱性，所以其核磁信號僅給出一半，另一半基本重合。此外，化合物 1核磁分析溶劑為CD3OD，結構中的羥基活潑氫信號未出現。將所得化合物的一維核磁數據同文獻報道的化合物efomycin G、11,11'-O,O-dimethyleliophylin、elaiophylin的核磁數據[12-13]比對，結果顯示其譜圖一致，化合物 1 具體信號歸屬見表 1，化合物 2、3 具體信號歸屬見表 2。

圖 1 菌株 256 與相關菌株的系統進化樹

Figure 1 Phylogenetic tree of strain 256 and related type strains

圖 2 化合物 1 ~ 3 的 HPLC 圖譜

Figure 2 The HPLC analysis of compounds 1 - 3

1：R1 = R2 = R3 = H 2：R1 = R2 = R3 = CH3 3：R1 = CH3，R2 = R3 = H

Figure 3 Chemical structures of compounds 1 - 3

表1 化合物1 的NMR數據（CD3OD-d4）

表 2 化合物2、3的NMR數據（DMSO-d6）

續表 2

δH mult. [J in (Hz)]δCδH mult. [J in (Hz)]δC 15，15'3.39，m66.993.77，m65.11 16，16'1.13，d（6.1）19.021.06，d（6.1）19.47 17，17'0.98，d（6.5）15.660.98，d（6.5）15.83 18，18'0.86，d（7.3）10.030.80，d（6.5） 9.86 19，19'0.84，d（7.2） 7.320.87，d（7.0） 7.28 20，20'a1.61，m18.841.59，m19.12 20，20'b1.38，m1.39，m 21，21'0.79，t（7.5） 8.890.79，t（6.5） 9.09 22，22'4.92，d（3.2）92.564.93，d（3.1）92.80 23，23'a1.80，td（12.3，3.7）32.741.81，m32.97 23，23'b1.38，m1.39，m 24，24'3.72，m65.013.72，m65.23 25，25'3.39，m70.383.39，s70.58 26，26'3.74，m66.443.74，m66.71 27，27'1.07，d（6.5）17.221.09，d（6.5）17.42 OMe-11，11'2.95，s45.74 OH-9，9'4.38，d（7.3） 4.47，d（6.8） OH-11，11' 5.42，s OH-24，24'4.52，d（4.9） 4.50，d（5.8） OH-25，25'4.27，d（4.4） 4.26，d（4.5）

Figure 4 Effects of multiple concentrations of compounds 1 - 3 on proliferation of MDA-MB-231 cell line (A: Compound 1; B: Compound 2; C: Compound 3)

2.3 化合物 1、2、3 的抗菌活性及體外抗癌細胞MDA-MB-231 活性測定

據文獻報道，該類化合物具有細胞周期抑制劑和細胞凋亡誘導劑的功能[8-9]，因此，利用 MTT 法對化合物 1、2、3 的體外抗乳腺癌細胞增殖活性進行評價，其中化合物 2 測定 4 個濃度值的抗細胞增殖活性，化合物 1、3 分別測定 5 個濃度值的抗細胞增殖活性。結果顯示均對體外培養的人乳腺癌細胞 MDA-MB-231 增殖具有差異性抑制作用（圖4），化合物 1、3對 MDA-MB-231 細胞增殖顯示較強的抑制活性，IC50分別為4.385、2.118 μmol/L，而化合物 2 對 MDA-MB-231 細胞增殖抑制活性較低，IC50> 75 μmol/L。

2.4 基于 Gluc 報告系統的化合物 3 抑制甲型流感病毒活性

實驗結果顯示，化合物3在0.1 μmol/L 和0.3 μmol/L 的濃度下對甲型流感病毒A/WSN/33 (H1N1) 抑制率分別為30.29% 和35.27%（表3），且在該濃度下細胞生長良好，未表現出較大的細胞毒性，初步說明該化合物對甲型流感病毒具有一定的抑制效果。

表 3 化合物 3 對流感病毒敏感株A/WSN/33(H1N1) 的抑制活性

2.5 化合物 1，2、3 初步構效關系研究

化合物1、2、3的體外抗腫瘤細胞MDA-MB-231活性結果顯示差異，對比化合物 2 和 3，兩者的唯一區別在于 C-11 位和 C-11' 位上有無甲基取代，化合物 3 在 C-11 位和 C-11'位上無甲基取代，對人乳腺癌細胞 MDA-MB-231 顯示出良好的抑制增殖活性；而化合物 2 在 C-11 位和C-11'位上的羥基均被甲基化，活性明顯降低，由此推測化合物結構中 C-11 位和 C-11'位的羥基為活性必需基團。吳春彥等[11]關于elaiophylins化合物抗人乳腺癌細胞MCF-7 的活性研究結果及Ritzau 等[9]關于elaiophylins 化合物對小鼠成纖維細胞、人白血病細胞、HeLa 細胞抑制活性結果研究佐證了這一推測。

3 討論

洋橄欖葉素類化合物常見抗菌及抗腫瘤細胞活性報道，尚未見抗病毒活性報道，化合物3 的體外抗流感病毒藥效學評價顯示，其對流感病毒藥物敏感株A/WSN/33(H1N1) 有一定的抑制活性，但尚不具備抗病毒成藥性，今后可通過對其結構修飾與改造進一步研究。依據本研究中體外抗人乳腺癌細胞 MDA-MB-231 增殖活性結果及文獻[8，12-13]報道的抗腫瘤細胞活性結果，推測化合物 3 C-11 位和 C-11'位羥基可能為活性必需基團，烷基取代能夠降低其抗細胞增殖活性；而化合物 2 C-11 位和 C-11'位甲基取代可能是由于制備過程中化合物 3 結構中活潑的半縮醛與甲醇反應產生的[13]。因此，在制備過程中應避免使用帶有羥基的溶劑。

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Study on the secondary metabolites of an endophyticCWJ-256 isolated from

WANG Xin-wei, GUO Wen-qiang, ZHAO Jian-yuan, YU Li-yan, XI Nan, HE Ning, WANG Shan-shan, YUAN Li-jie, XIE Yun-ying

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (WANG Xin-wei, GUO Wen-qiang, ZHAO Jian-yuan, YU Li-yan, XI Nan, HE Ning, WANG Shan-shan, XIE Yun-ying); Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases, Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China (YUAN Li-jie)

The aim of the study is to isolate and identify the bioactive secondary metabolites from the fermentation broth of the endophytic. CWJ-256 isolated from the plant.

Phylogenetic analyses were based on 16S rRNA gene sequence. The bioactive metabolites were isolated by silica gel chromatography and preparative HPLC by guidance of antibacterial activity. HRMS and NMR were employed to characterize the structures of purified compounds. The anti-proliferation activities against human breast cancer cells were assayed by MTT, and the anti-influenza virus activities were tested by Gluc report system.

CWJ-256 was identified as. Three compounds were isolated and identified as efomycin G (1), 11,11'-O,O-dimethylelaiophylin (2), elaiophylin (3), respectively. Compounds 1 and 3 displayed anti-proliferation potential against human breast cancer cell MDA-MB-231, and the compound 3 showed weak activity against influenza virus A/WSN/33(H1N1).

TheCWJ-256 can produce elaiophylin and its analogues which exhibited antibacterial, antitumor and anti-virus activities.

ACANTHOPANAX SENTICOSUS; Endophytic actinomycetes; Elaiophylin; Anti-proliferation potential; Anti-influenza virus activity

XIE Yun-ying, Email: xieyy@imb.pumc.edu.cn; YUAN Li-jie, Email: yuanlijie1970@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.003

北京市自然科學基金（7172137）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（2016-I2M-2-002）；河北省自然科學基金（C2014209137）

解云英，Email：xieyy@imb.pumc.edu.cn；袁麗杰，Email：yuanlijie1970@163.com

2018-04-26