肺癌與多瘤病毒和皰疹病毒感染關系的初步研究

趙巍，胡秦，路通，程淵，李勁濤

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肺癌與多瘤病毒和皰疹病毒感染關系的初步研究

趙巍，胡秦，路通，程淵，李勁濤

100035 北京市藥品檢驗所/北京市保健食品化妝品檢驗中心（趙巍）；100124 北京工業大學生命科學與生物工程學院（胡秦、路通、李勁濤）；100034 北京大學第一醫院呼吸和危重癥醫學科（程淵）

探討常見多瘤病毒和皰疹病毒感染與肺癌的關系。

巢式 PCR 檢測 26 例肺癌樣本和 10 例非瘤肺部樣本中的 BK 多瘤病毒、JC 多瘤病毒、皰疹病毒HHV-6、HHV-7、HHV-8 和 EB 病毒的存在情況。

肺癌組織中 HHV-6、HHV-7 和 EB 病毒 DNA 陽性率分別為 17.4%、13.0% 和 60.9%，非瘤肺部樣本中 HHV-6、HHV-7 和 EB 病毒 DNA 陽性率分別為 0、12.5% 和 12.5%。在肺癌組織的 EB 病毒感染與非瘤組織 EB 病毒感染存在顯著性差異（< 0.05）。所有樣本中均未檢出 BK 多瘤病毒、JC 多瘤病毒和 HHV-8 DNA。

EB 病毒在肺癌和非瘤肺組織的表達存在顯著性差異，肺癌組織的 EB 病毒的感染在肺癌患者中普遍存在，可能對肺癌患者的治療和預后有一定影響。

肺腫瘤； 多瘤病毒感染； 皰疹病毒科感染

腫瘤與慢性病毒感染的關系長期以來一直是腫瘤病因學的研究熱點，多種病毒被發現與腫瘤發生具有相關性，如世界衛生組織（WHO）已將人乳頭瘤病毒（HPV）確定為宮頸癌的主要病因[1]，此外，大量研究還發現 EB 病毒（EBV）感染與鼻咽癌和兒童淋巴瘤的發生密切相關[2]，人乙型肝炎病毒（HBV）在肝細胞癌變中發揮重要作用等[3]。病毒的反復持續感染、病毒基因整合、機體免疫力低下、遺傳易感等均是促進正常細胞惡性轉化的重要因素。

肺癌是我國乃至全球范圍內發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，且發病率呈現逐年上升趨勢[4]。肺癌的發病機制尚不完全明確，多數研究認為肺癌的發生是多種刺激因素與機體潛在因素（如吸煙、遺傳因素、電離輻射、空氣污染等）綜合作用的結果，其中病毒感染與肺癌發生和發展的關系仍不完全清楚。本文應用巢式 PCR 技術檢測肺癌組織中常見多瘤病毒和皰疹病毒的存在情況，探討病毒感染與肺癌發生和發展的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

從北京大學第一醫院收集，因臨床病情需要手術切除肺組織及支氣管鏡活檢取樣肺組織共36 例，其中肺癌組織 26 例和非腫瘤組織 10 例，標本經病理學診斷確認。其中肺癌組織中男 20 例，女 6 例，平均年齡為 64.15 歲（52 ~ 83 歲），包括肺大細胞癌 1 例，肺小細胞癌 4 例，肺鱗癌10 例，肺腺癌 6 例，其他腫瘤 5 例。對照組為非腫瘤組織，為肺部急慢性炎癥患者，其中男 7 例，女 3 例，平均年齡為 58.75 歲（45 ~ 69歲），所有標本均經患者及家屬的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 組織 DNA 提取和質量鑒定 組織樣品取樣后，于–80 ℃保存。凍存樣本經 PBS 緩沖液清洗后研磨，加入 DNA 提取液和蛋白酶 K 消化組織，提取 DNA，DNA 保存于–20 ℃。為鑒定 DNA 提取質量，采用 PCR 擴增內參基因 β-globin，擴增引物為 β-globin-F：5' CAACTT CATCCACGTTCACC 3'，β-globin-R：5' GAAGAG CCAAGGACAGGTAC 3'。引物由北京天一輝遠公司合成。

1.2.2 病毒核酸檢測 設計 BK 多瘤病毒（BKV）、JC 多瘤病毒（JCV）、皰疹病毒 HHV-6、HHV-7、HHV-8 和 EBV 的擴增引物（表 1），由北京天一輝遠公司合成。組織 DNA 樣本采用巢式PCR 擴增，擴增產物采用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣本經回收后送測序，經序列比對后判斷是否為陽性。

表 1 擴增引物序列

2 結果

2.1 組織 DNA 提取質量分析

提取肺部組織的總 DNA，利用 PCR 擴增內參 β-globin 基因后檢測 DNA 質量，其 PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖 1 所示，在 36 份組織樣本中，有 31 份樣本經內參擴增檢測為陽性（包括 23 份癌組織樣本和 8 份對照樣本），表明提取的組織 DNA 質量較完整，可以進行下一步檢測，5 份陰性樣本不計入后續實驗檢測。

2.2 肺癌組織病毒核酸檢出結果

肺部組織樣本經巢式 PCR 擴增及測序片段比對分析后，對 31 份樣本分別進行 BKV、JCV、HHV-6、HHV-7、HHV-8 和 EBV 的 PCR 核酸檢測，結果如表 2 所示。肺癌及對照患者的組織中 BKV、JCV 和HHV-8 均未檢出。肺癌組織（n = 23）中共檢出 4 份 HHV-6，3 份 HHV-7 陽性樣本和 14 份 EBV 陽性樣本，陽性率分別為 17.4%、13.0% 和 60.9%。對照組織（n = 8）中共檢出 1 份 HHV-7 陽性樣本和 1 份 EBV 陽性樣本，陽性率均為 12.5%，未檢出 HHV-6 陽性樣本。肺癌組與對照組的 HHV-6 和 HHV-7表達無顯著性差異。肺癌組與對照組的 EBV 表達具有顯著性差異（< 0.05）。

M：分子量標準；1 ~ 36：組織 DNA 樣本

Figure 1 Agarose gel electrophoresis of β-globin PCR products

表 2 肺部組織的病毒核酸檢出結果

3 討論

本文檢測了多種常見多瘤和皰疹病毒感染與肺癌的關系。多瘤病毒和皰疹病毒均是具有潛在致瘤性的病毒。其中 BKV 和 JCV 是兩種常見的多瘤病毒，初次感染發生在嬰幼兒時期，在普通人群中的感染可達 80% 或以上，可潛伏于多個器官組織，并可經呼吸道、消化道、器官移植等傳播。BKV 首次發現于腎移植后出現腎衰竭患者的尿液中，JCV 首次發現于進行性多灶性白質腦病腦組織中。BKV 和 JCV 對健康人群不致病，多無臨床癥狀，但在免疫低下人群中潛伏激活，表現出多種臨床癥狀，如移植性腎損害、膀胱炎等。多項研究表明 BKV 和 JCV 感染與結腸癌和前列腺癌等具有相關性[5-7]，尚無研究證實 BKV 病毒感染與肺癌相關性，在我們的肺癌檢測樣本和對照樣本中，也尚未發現 BKV 和 JCV 核酸檢出。

人皰疹病毒為雙鏈 DNA 病毒，可分為 α、β 和 γ 亞型，其中 HHV-6 和 HHV-7 屬于 β 亞型，具有 75% 的同源性，對 T 淋巴細胞具有高度親嗜性，在普通人群中感染率高，原發感染多發生在嬰幼兒時期，是幼兒急疹和玫瑰疹的主要病因之一。HHV-6 潛伏感染與多發性硬化和移植后疾患有關，在口腔鱗癌等腫瘤中有 HHV-6 檢出，在胃腸道腫瘤患者血液中也有檢出 HHV-6 和 HHV-7 激活。HHV-6 和 HHV-7 與肺部疾病的關系尚不明確，有個案報道小細胞肺癌患者出現 HHV-6 激活誘發腦炎[8]，在移植病后肺炎（IPS）中也發現了 HHV-6 檢出[9]。本文檢測肺部良性疾病（肺炎等）和癌組織樣本均有發現 HHV-6 和HHV-7 檢出，沒有顯著性差異。

EBV 和 HHV-8 同屬于 γ 型皰疹病毒，與多種腫瘤發生有關。其中 HHV-8 又稱卡波西肉瘤相關皰疹病毒，首次在 HIV-1 病毒攜帶并罹患卡波西肉瘤的患者體內發現，具有嗜淋巴細胞性致癌性，與卡波西肉瘤、原發性滲透性淋巴瘤等發病率具有密切相關性，與肺癌的關系尚無報道，本文也未檢出 HHV-8 陽性組織樣本。EBV 為 Epstein 和 Barr 首次從 Burkitt 非洲兒童淋巴瘤細胞中分離獲得，是多種惡性腫瘤的病因之一，EBV 感染人咽部上皮細胞和 B 淋巴細胞，經唾液、直接接觸及血液傳播，全球普通人群感染超過 90%，在健康人群無明顯癥狀或無癥狀。在免疫低下時誘導細胞病理改變，EBV 感染被發現與傳染性單核細胞增多、淋巴瘤和鼻咽癌關系密切[2]。在肺癌研究中，以往認為 EBV 病毒感染在亞洲患者中僅與肺淋巴上皮瘤樣癌有關，高水平的 EBV DNA 檢出可作為肺淋巴上皮瘤樣癌的不良預后標志物[10]，但近年來多項研究發現在肺腺癌和肺鱗癌組織均有 EBV 檢出[11-16]，表明 EBV 的潛伏激活與多種肺癌具有關系。本文在 23 份肺癌組織中檢出 14 份 EBV 陽性樣本，陽性率高達 60.9%，其中，肺癌組織樣本包括 B 細胞淋巴瘤等，與 EBV 感染關系密切，檢出率較高，此外，EBV 在腺癌和小細胞肺癌中均有高表達。受樣本病例數限制，不同病理亞型肺癌組織與 EBV 感染的關系還不明確，有待進一步研究證實。

[1] Wollenberg, B. Cancer immunology and HPV. RRecent Results Cancer Res, 2017, 206:243-248.

[2] Raghupathy R, Hui EP, Chan AT. Epstein-barr virus as a paradigm in nasopharyngeal cancer: From lab to clinic. Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2014:149-153.

[3] Ringelhan M, O'Connor T, Protzer U, et al. The direct and indirect roles of HBV in liver cancer: prospective markers for HCC screening and potential therapeutic targets. J Pathol, 2015, 235(2):355-367.

[4] Torre LA, Siegel RL, Jemal A. Lung cancer statistics. Adv Exp Med Biol, 2016, 893:1-19.

[5] Anzivino E, Rodio DM, Mischitelli M, et al. High frequency of JCV DNA detection in prostate cancer tissues. Cancer Genomics Proteomics, 2015, 12(4):189-200.

[6] Levican J, Acevedo M, León O, et al. Role of BK human polyomavirus in cancer. Infect Agent Cancer, 2018, 13:12.

[7] Khabaz, MN, Nedjadi T, Gari MA, et al. BK polyomavirus association with colorectal cancer development. Genet Mol Res, 2016, 15(2).

[8] Mordenti P, Zaffignani E, Immovilli P, et al. Human herpesvirus 6 encephalitis simulating brain metastases in a patient with advanced small-cell lung cancer. Chemotherapy, 2013, 59(5):385-386.

[9] Seo S, Renaud C, Kuypers JM, et al. Idiopathic pneumonia syndrome after hematopoietic cell transplantation: evidence of occult infectious etiologies. Blood, 2015, 125(24):3789-3797.

[10] Xie M, Wu XJ, Wang F, et al. Clinical significance of plasma epstein-barr virus DNA in pulmonary lymphoepithelioma-like carcinoma (LELC) patients. J Thorac Oncol, 2018, 13(2):218-227.

[11] Gómez-Román JJ, Martínez MN, Fernández SL, et al. Epstein-Barr virus-associated adenocarcinomas and squamous-cell lung carcinomas. Mod Pathol, 2009, 22(4):530-537.

[12] Wang MM, Xiong YN, Zhang SJ, et al. Correlation of Epstein-Barr virus infection and clinical features of patients with lung cancer. Jiangsu Med J, 2013, 39(17):2042-2043. (in Chinese)

王梅梅, 熊亞南, 張淑杰, 等. EB病毒感染與肺癌患者臨床特征的相關性. 江蘇醫藥, 2013, 39(17):2042-2043.

[13] Wang MM, Xiong YN, Zhu LH, et al. Expressions of LMP-1, p53, Bcl-2 and MMP-9 in tissues of lung cancer with Epstein-Barr virus infection. J Chin Oncol, 2013, 19(6):431-434. (in Chinese)

王梅梅, 熊亞南, 朱麗華, 等. EB病毒陽性肺癌組織中LMP-1、p53、Bcl-2及MMP-9表達. 腫瘤學雜志, 2013, 19(6):431-434.

[14] Gupta P, Haldar D, Naru J, et al. Prevalence of human papillomavirus, Epstein-Barr virus, and cytomegalovirus in fine needle aspirates from lung carcinoma: a case-control study with review of literature. Diagn Cytopathol, 2016, 44(12):987-993.

[15] Jafarian AH, Omidi-Ashrafi A, Mohamadian-Roshan N, et al. Association of Epstein Barr virus deoxyribonucleic acid with lung carcinoma. Indian J Pathol Microbiol, 2013, 56(4):359-364.

[16] Koshiol J, Gulley ML, Zhao Y, et al. Epstein-Barr virus microRNAs and lung cancer. Br J Cancer, 2011, 105(2):320-326.

Correlation between lung cancer and polyomavirus/herpesvirus infection

ZHAO Wei, HU Qin, LU Tong, CHENG Yuan, LI Jin-tao

Beijing Institute for Drug Control/Beijing Center for Health and Cosmetics Control, Beijing 100035, China (ZHAO Wei); College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China (HU Qin, LU Tong, LI Jin-tao); Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China（CHENG Yuan）

To investigate the correlation between lung cancer and polyomavirus/herpesvirus infection.

Nested PCR were conducted to detect the expression of BKV, JCV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 and EBV in 26 lung cancer tissues and 10 controls.

In the lung cancer tissue, the positive rate of HHV-6, HHV-7 and EBV DNA were 17.4%, 13.0% and 60.9%, respectively, whereas in the control samples, the positive rate of HHV-6, HHV-7 and EBV DNA were 0, 12.5% and 12.5%, respectively. The expression of BKV, JCV and HHV-8 were not detected in all the samples.

Significant difference of EBV infection between lung cancer and control tissues is observed, indicating that EBV might be involved in the pathogenesis and prognosis of lung cancer.

Lung neoplasms; Polyomavirus infections; Herpesviridea infections

CHENG Yuan, Email: softsnake@bjmu.edu.cn; LI Jin-tao, Email: ljt2008@bjut.edu.cn

北京市自然科學基金（7182012）

程淵，Email：softsnake@bjmu.edu.cn；李勁濤，Email：ljt2008@bjut.edu.cn

2018-07-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.006