松脂醇二葡萄糖苷對光老化HDF細胞ER/TGF-β1/Smads信號通路的調控機制

高海娜，蔡周權，林鶯，文霞，孫慧峰

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松脂醇二葡萄糖苷對光老化HDF細胞ER/TGF-β1/Smads信號通路的調控機制

高海娜，蔡周權，林鶯，文霞，孫慧峰

621000 綿陽，四川省科學城醫院藥劑科（高海娜、蔡周權、林鶯、文霞）；150040 哈爾濱，黑龍江中醫藥大學藥學院（孫慧峰）

從分子生物學水平探討杜仲中松脂醇二葡萄糖苷（PDG）對光老化人真皮成纖維細胞（HDF）ER/TGF-β1/Smads 信號通路的調控機制。

建立以長波紫外線模型損傷 HDF 細胞。給予不同濃度 PDG 和通路阻斷劑進行干預，用MTT 檢測細胞增殖率，Real time-PCR 和 Western blot 法檢測各組細胞內含有的信號轉化生長因子（TGF-β1）、轉導分子（Smad3）、I 型膠原（COL1A1）對應 mRNA 和蛋白的表達。

與空白組比較，模型組增殖率及 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 和蛋白表達均顯著降低（< 0.01）；與模型組比較，各給藥組增殖率和 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 和蛋白表達均顯著升高（< 0.01）；與 PDG 高濃度組比較，TGF-β1、Smad3、ER 三個阻斷劑組相對應的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 相應 mRNA 和蛋白表達均顯著降低（< 0.01）。

PDG 能增加 HDF 細胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 對應 mRNA 和蛋白表達，對光老化 HDF 細胞膠原合成有促進作用；但這種作用能被 TGF-β1、Smad3 和 ER 阻斷劑所抑制，PDG 促進膠原合成的作用機制可能與 ER/TGF-β1/Smads 信號通路有關。

松脂醇二葡萄糖苷； 人真皮成纖維細胞； 植物雌激素； ER/TGF-β1/Smads 信號通路

長波紫外線（UVA）可以導致表皮中的角質形成細胞以及真皮的纖維細胞構型異常的轉變[1-4]。杜仲對正常成纖維細胞 I 型膠原蛋白有保護作用，但具體成分還不明確[5-6]。杜仲中松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，PDG）是一種天然弱雌激素樣物質，它與皮膚光老化有密切關系。有研究揭示光老化患者皮膚中雌激素受體β（ERβ）的表達強度和老化的嚴重程度有著密切的關系，雌激素受體在光老化患者皮膚中發揮了重要作用[7-8]。Smads 蛋白家族是一種轉錄因子，它是 TGF-β 受體作用的中介物質[9-10]。Son 等[11]報道 17β 雌二醇（E2），可促進TGF-β1 和 Smad3 表達增加，使膠原合成增加，表明在 TGF-β/Smad 信號通路調控機制中 17β 雌二醇促進了膠原的合成，可用于治療人的皮膚病。膠原合成主要通過 ER/TGF-β/Smads 信號通路實現，植物雌激素成分干預膠原蛋白合成的作用機制為合理利用中藥植物促激素預防皮膚光老化等疾病提供理論依據[12]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人真皮成纖維細胞（HDF）購自美國 Sciencell 公司。

1.1.2 試劑 17β 雌二醇純度為 98%，購買于北京百靈威科技有限公司，生產批號為 L750N46；PDG 純度為 98%，購買于寶雞市辰光生物科技有限公司，生產批號為 MUST-13021001；COL1A1 阻斷劑 SB431542（生產批號301836-41-9）和Smad3 阻斷劑 SIS3（生產批號 1009104-85-1）以及TGF-β1、COL1A1、Smad3、HRP 標記羊抗兔 IgG 均購自Santa Cruz Biotechnogy；TGF-β1 阻斷劑 ICI182780（生產批號 20A/129473）購自 Tocris 公司；HRP 標記羊抗小鼠 IgG 購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 UVA 紫外照射儀購自北京師范光電儀器廠；MK3 型酶標儀購自上海熱電儀器有限公司；WD9405B 型水平搖床購自北京市六一儀器廠；TCL6G-C 型高速臺式冷凍離心機購自上海安亭科學儀器廠；Mini-Protean Tetra Cell 型電泳儀購自Bio-Rad 公司；PCR 自動擴增儀購自德國Biometra 公司；Smart ChemiTM500 型一體式微型化學發光成像儀和ChamlGelTM5000 透射紫外觀察儀及凝膠成像系統購自北京賽智創業科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將對數期生長的 HDF 細胞，以 105每孔接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2條件下，用 FM 培養液培養。實驗分組為空白組（2 ml FM + 培養 24 h）、模型組（2 ml FM + 培養 23 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培養 1 h）、陽性對照組（10-3μmol/L 雌二醇 + 2 ml FM + 培養23 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培養 1 h）、藥物低劑量組/ 藥物中劑量組/ 藥物高劑量組（10-1μmol/L /1 μmol/L / 10 μmol/L PDG + 2 ml FM + 培養 23 h+ 20 J/cm2UVA 照射 + 培養 1 h）、阻斷劑組（1 μmol/L ICI182780 / 10 μmol/L SIS3 / 10 μmol /L SB431542 培養 1 h + 10 μmol/L PDG + 2 ml FM + 培養 22 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培養 1 h），每組均設 4 個復孔。

1.2.2 MTT 檢測 細胞培養 20 h 后，每孔加入 20 μl 濃度為 5 g/L 的 MTT，再繼續培養 4 h 后，除去上清液，每孔加 150 μl DMSO，將 96 孔板置于 37 ℃恒溫振蕩培養器內振蕩 10 min，使紫色結晶完全溶解。酶標儀 490 nm 波長處測定吸光度。

1.2.3 Real time-PCR 反應 取對數增長 HDF 細胞，使用裂解液提取總的 RNA，用 Nano-100 測定總 RNA 的濃度及純度，將 RNA 反轉錄為 cDNA 置于–20 ℃冰箱儲存待用，選 GAPDH 為內參，引物序列見表 1，反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 30 s；58 ℃退火/延伸60 s，2 ℃延伸 60 s，31 個循環；2 ℃延伸 60 s。然后每孔 10 μl 將擴增產物加入到瓊脂糖凝膠進行 120 V 30 min 電泳，最后在凝膠成像系統進行檢測，循環閾值即 Ct 值，每組設三個平行實驗。按照 2-△△Ct法分析細胞內目的基因相對于內參基因的 mRNA 的相對表達量。△△Ct =（Ct目的基因– Ct內參基因）給藥組–（Ct目的基因– Ct內參基因）對照組。

1.2.4 Western blot 取對數增長 HDF 蛋白濃度，計算出樣品蛋白濃度，將 10 μl 蛋白樣品加入對應的膠孔中，電泳儀電壓為 100 V，電泳 60 min。半干轉膜儀電壓為 10 V，轉染 0.5 h。脫脂奶粉封閉 2 h，一抗（1:330）孵育 4 ℃過夜，TBST 洗3 遍，二抗（1:10000）孵育 1 h，TBST 再洗 3 遍，將 PVDF 膜稍微淋一下，加 ECL 顯色，暗室顯影，攝影并進行分析。采用 LaneID 凝膠分析系統，分析各條帶的灰度值，以靶條帶的灰度值和內參的灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 采用 MTT 法檢測 PDG 對 UVA 照射 HDF 細胞增殖作用的影響

實驗結果如表 2，與空白組相比，模型組的 HDF 細胞增殖率顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，PDG 低中高（10-1μmol/L、1 μmol/L 和10 μmol/L）三種劑量對 HDF 細胞的增殖率均具有促進作用（< 0.05）。

2.2 PDG 對光老化 HDF 細胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達的影響

實驗結果如表 3，與空白組相比，模型組中 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 mRNA 表達均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，陽性對照組和 PDG 高劑量組 TGF-β1、Smad3 和COL1A1 mRNA 表達均顯著增加（< 0.01）。

2.3 PDG 對光老化 HDF 細胞 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 蛋白表達的影響

實驗結果如表 4 和圖 1，與空白組相比，模型組 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，陽性對照組和PDG 低劑量組、中劑量組、高劑量組中 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達均顯著增加（< 0.01）。

表 1 引物

表 2 PDG 對 UVA 照射 HDF 細胞增殖率的影響（，n = 6）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較*< 0.05。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,*< 0.05.

表 3 PDG 對光老化 HDF 細胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達的影響（，n = 3）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,**< 0.01.

表 4 PDG 對光老化 HDF 細胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白表達的影響（，n = 3）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,**< 0.01.

A: Control; B: UVA + E2 (10-3μmol/L); C: 20 J/cm2UVA; D: UVA + PDG (10-1μmol/L); E: UVA + PDG (1 μmol/L); F: UVA + PDG (10 μmol/L)

Figure 2 Effect of PDG on expression of TGF-β1, Smad3 and COL1A1 protein in photo-aging HDF cells

2.4 阻斷 ER/TGF-β1/Smads 后 PDG 對光老化HDF 細胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達的影響

實驗結果如表 5，與空白組相比，模型組中TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，PDG 高劑量組 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達均顯著增加（< 0.01）；與 PDG 高劑量組相比，TGF-β1 阻斷劑 SB431542、Smad3 阻斷劑 SIS3、雌激素受體阻斷劑 ICI182780相對應的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 mRNA 表達均顯著減少（< 0.01）。

表 5 阻斷 ER/TGF-β1/Smads 后 PDG 對光老化 HDF 細胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達的影響（，n =3）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01；與藥物高劑量組比較#< 0.01。

Note: Compared with the blank group##< 0.01; compared with the model group**< 0.01; compared with the high dose group#< 0.01.

組別 GroupsTGF-β1/β-actinSmad3/β-actinCOL1A1/β-actin 空白組 Control0.636 ± 0.0140.889 ± 0.0120.982 ± 0.042 UVA0.234 ± 0.019##0.262 ± 0.018##0.331 ± 0.023## UVA + PDG0.462 ± 0.013**0.501 ± 0.016**0.564 ± 0.018** UVA + PDG + SB4315420.275 ± 0.018#0.392 ± 0.017#0.438 ± 0.015# UVA + PDG + SIS30.282 ± 0.023#0.301 ± 0.011#0.430 ± 0.068# UVA + PDG + ICI1827800.322 ± 0.016#0.332 ± 0.021#0.392 ± 0.026#

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01；與藥物高劑量組比較#< 0.01。

Note: Compared with the blank group##< 0.01; compared with the model group**< 0.01; compared with the high dose group#< 0.01.

A: Control; B: UVA; C: UVA + PDG; D: UVA + PDG + SB431542; E: UVA + PDG + SIS3; F: UVA + PDG + ICI182780

Figure 2 Influence of PDG on expression of TGF-β1, Smad3 and COL1A1 proteins in photoaging HDF cells after blocking ER/TGF-β1/Smads

2.5 阻斷ER/TGF-β1/Smads后PDG對光老化HDF細胞TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白表達的影響

實驗結果如表 6 和圖 2，與空白組相比，模型組中 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，PDG 高劑量組 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達均顯著增加（< 0.01）；與 PDG 高劑量組相比，TGF-β1 阻斷劑 SB431542、Smad3阻斷劑 SIS3、雌激素受體阻斷劑 ICI182780相對應的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 蛋白的表達均顯著減少（< 0.01）。

3 討論

皮膚的光老化嚴重影響人們的容顏，給人身體造成嚴重心理負擔。皮膚光老化主要發病的原因是膠原合成減少，而膠原合成主要通過 ER/TGF-β/Smads 信號通路實現，其中 TGF-β1、Smad3、I 型膠原在 HDF 細胞中的表達可以作為評估光老化模型的特異性指標[13-15]。選擇植物雌激素來研究其對膠原合成的影響及其調控機制，對于尋找安全有效的治療皮膚光老化的天然植物類藥物具有重大意義。

綜上所述，PDG 能通過影響 ER/TGF-β1/Smads 信號通路顯著上調 UVA 誘導的光老化 HDF 細胞 TGF-β1、Samd3、COL1A1 蛋白及 mRNA 的表達，增加光老化 HDF 細胞的增殖能力，為中藥治療光老化等皮膚疾病提供了理論基礎和實驗依據。

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Regulatory role of pinoresinol diglucoside in the ER/TGF-β1/Smads signaling pathways in photo-aged HDF cells

GAO Hai-na, CAI Zhou-quan, LIN Ying, WEN Xia, SUN Hui-feng

Sichuan Science City Hospital, Mianyang 621000, China (GAO Hai-na, CAI Zhou-quan, LIN Ying, WEN Xia); Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China (SUN Hui-feng)

To study the effect of pinoresinol diglucoside (PDG) on the ER/TGF-β1/Smads signaling pathways in photo-aged human dermal fibroblasts (HDF) cells.

A long wave ultraviolet (UVA) model was established to damage the HDF cells, and different concentrations of PDG and ER/TGF-β1/Smads signaling pathway inhibitors were added. The cell proliferation rate was detected by MTT, and the expression of signal transforming growth factor (TGF- β1), transduced molecule (Smad3) and type I collagen (COL1A1) expression were detected by RT-PCR and Western blot method.

Compared with the control group, the proliferation rate and the expression of TGF-β1, Smad3, COL1A1 mRNA and protein in the UVA irradiated model group were significantly decreased (< 0.01). Compared with the model group, the proliferation rate and TGF-β1, Smad3, and COL1A1 expression were significantly increased after PDG treatment (< 0.01). Compared with the high concentration of PDG group, the expression of TGF-β1, Smad3, and COL1A1 expression were significantly decreased, respectively, upon the treatment with respective inhibitor (< 0.01).

PDG increased the expression of TGF- β1, Smad3 and COL1A1 in HDF cells after UVA irradiation, and this effect can be inhibited by TGF-β1, Smad3 and ER inhibitor.

Pinoresinol diglucoside; Human dermal fibroblasts cells; Phyto-oestrogens; ER/TGF-β1/Smad3 signaling pathway

SUN Hui-feng, Email: huifengsun@hotmail.com

孫慧峰，Email：huifengsun@hotmail.com

2018-07-23

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.007