實驗室小規模微生物瓊脂平板發酵培養操作模式優化

王靜，孫桂芝，江冰婭，李書芬，黎林麗，胡笑文，胡曉敏，左利杰，武臨專

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實驗室小規模微生物瓊脂平板發酵培養操作模式優化

王靜，孫桂芝，江冰婭，李書芬，黎林麗，胡笑文，胡曉敏，左利杰，武臨專

100050 北京，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所衛健委抗生素生物工程重點實驗室

微生物發酵主要分為固態和液態兩種模式，在實驗室和工業生產中，固態和液態發酵培養均具有廣泛的應用。在科研單位微生物實驗室中，瓊脂平板（或培養皿）和搖瓶分別是微生物固態與液態發酵培養的常用器皿；瓊脂培養基平板不僅可以用于制備液態發酵的起始種子或孢子懸液，更可以為科研單位微生物實驗室提供一定數量的發酵培養物，用于分離純化或積累目標樣品化合物。

近年來，本文作者及所在課題組對微生物（主要是放線菌）進行瓊脂平板發酵培養，然后收集發酵培養物，從中發現具有新結構或新活性的次級代謝產物，獲得了較好研究結果或積極回報[1-9]。

在實際工作中，實驗室目前使用的微生物瓊脂平板發酵培養操作方法，從配制發酵培養基、倒瓊脂平板，再到接種微生物種子（孢子）懸液，仍然是傳統的手工操作模式，具有勞動強度高、工作效率低、瓊脂平板不夠標準化等缺點。因此，圍繞這些問題，我們在實踐中進行了如下三方面改進。

⑴培養基配制：微生物發酵培養基中一般含有黃豆餅粉、棉籽餅粉等難溶性成分，也經常包含淀粉等需要糊化后使用的成分。在將各種培養基成分稱量、混合并加水懸浮或部分溶解后，首先需要使用電爐或電磁爐進行加熱預處理，使其膨脹、溶解或糊化，然后才能進行分裝和滅菌處理。特別是在加熱預處理過程中，需人工對培養基進行攪拌和看護。我們使用豆漿機（圖 1），采用其預設程序，實現了對加熱和攪拌的自動化和智能化合并處理，不再需要人工攪拌

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⑵倒平板：傳統方法是手工倒瓊脂平板，工作強度大，倒出的瓊脂平板也不標準化（每個平板的培養基裝量不完全一致），有可能導致微生物發酵培養周期的不同步。改進的方法是使用分配型蠕動泵（圖 1），即將硅膠管的兩端連接上止回閥和不銹鋼吸管，然后滅菌；將硅膠管安裝到蠕動泵的泵頭，不銹鋼吸管一端插到滅菌后的培養基中，在蠕動泵上設定每個平板的培養基分裝體積，操作（可以安裝腳踏板控制）蠕動泵實現半自動化的倒瓊脂平板操作，并且每個瓊脂平板的裝量完全一致。此外，改變蠕動泵的液晶控制面板參數可以方便地對培養基裝量進行調整。如果需要倒多種不同發酵培養基配方的瓊脂平板，那么用無菌水在線蠕動清洗殘留有之前培養基（即使培養基瓊脂凝固了也不要緊）的硅膠管后，就可以更換發酵培養基繼續倒下一批瓊脂平板了。

⑶接種：傳統方法是首先使用滴管將種子或孢子懸液分配到每個平板中，然后采用玻璃三角棒將種子或孢子懸液均勻涂布于平板培養基表面，屬于兩步人工操作，特別是使用玻璃三角棒把種子或孢子懸液涂布均勻，費時費力。改進方法是使用硅膠刷（圖 1），與玻璃三角棒相比，硅膠刷的毛軟而富有彈性，可反復高壓滅菌，非常結實耐用，并且每次使用后的清洗也非常方便。操作過程中，只需將硅膠刷沾一下種子或孢子懸液，每次吸附0.5 ~ 1.5 ml 懸液（與硅膠刷的大小和毛數有關），然后直接涂布發酵培養平板，硅膠刷在瓊脂培養基平板的表面行走流暢，使得分配涂布種子懸液更加快速而均勻。與使用滴管和玻璃三角棒相比，由于硅膠刷將傳統的兩步操作合并為一步，因而大大提高了工作效率，例如原來一般需要 2 h 才能完成的接種工作量，現在可以 1 h 內完成，減少了工作時間，降低了勞動強度。

雖然國內外已經有商業化的全自動培養基分裝設備用于液體培養基分裝和熔融的瓊脂培養基分裝（需要有保溫裝置），但是由于要求使用標準化的平板（培養皿），特別是每次使用的前期準備工作和使用后的收拾清理任務比較繁雜，加之科研單位實驗室的微生物發酵培養瓊脂平板的規格多，培養基組成配方的變化也多，尤其是需要的瓊脂平板數量一般不太大，所以全自動培養基分裝設備在科研單位微生物實驗室并沒有得到廣泛應用。

本文對小規模微生物瓊脂培養基平板的發酵培養操作模式進行優化，非常適合科研單位微生物實驗室，特別是結合使用無菌化的一次性塑料平板（培養皿），可以高效地完成實驗室規模（例如 5 ~ 25 L）的微生物瓊脂培養基平板的發酵培養，從而為后續的目標化合物分離純化以及積累一定量的研究測試樣品提供發酵培養物。

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左利杰, 趙薇, 江志波, 等. 濟南游動放線菌CPCC 200056產生的3-去甲創新霉素發現與鑒定. 藥學學報, 2016, 51(1):105-109.

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國家自然科學基金（81573328）

武臨專，Email：wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

2018-07-08

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.018