鹽酸益母草堿對破骨細胞生成的作用及機制研究*

張 怡，田坤明（遵義醫學院公共衛生學院，貴州遵義563000）

骨質疏松癥是全球公共健康衛生問題。在中國，年齡在60歲以上約有23％左右、80歲以上50％的人被診斷為骨科疾病[1]。骨質疏松癥是由于破骨細胞活動增加，導致骨密度降低，從而增加骨折風險[2]。骨密度降低的直接原因就是由于破骨細胞活躍所致的骨吸收效應，超過了成骨細胞的新骨形成速度。

目前，一些中藥在抗骨質疏松方面已經取得了顯著療效，包括淫羊藿[3]、女貞子[4]和補骨脂[5]等。女性在絕經后缺少雌性激素會增加破骨細胞的骨吸收能力[6]。鹽酸益母草堿（LH）基于益母草堿結構化學合成，于植物益母草中發現[7]。已有文獻報道，益母草堿可以提高雌二醇激素水平[8]，但益母草堿對于骨質疏松癥的治療作用及機制仍缺乏報道。本次實驗主要探討LH在體外對破骨細胞的成熟分化影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LH購自安徽新星藥業發展有限公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色使用白細胞酸性磷酸酶染色試劑盒購自Sigma公司，核因子κB抑制蛋白（IκBα）、磷脂酰肌醇 3?激酶（PI3K）和蛋白激酶 B（Akt）的磷酸化和非磷酸化抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠重組核因子κB受體活化因子配體（RANKL）購自PeproTech公司，RAW264.7細胞購于中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞來源及培養 為形成破骨細胞樣細胞，將RAW264.7細胞接種在 α?MEM培養基并且加入RANKL（100 ng∕mL）4～6 d，接種密度為 1×105。培養條件為5％CO2及37℃無菌環境中。

1.2.2 TRAP染色 RAW264.7細胞先用RANKL處理48 h，然后用不同濃度（0.5、1.0、2.0 μmol∕L）的 LH 處理48 h。隨后固定在3.7％多聚甲醛10 min，根據試劑盒說明書進行TRAP染色，在顯微鏡下3個或4個TRAP核染色陽性的細胞就是破骨細胞。

1.2.3 MTT實驗 采用MTT實驗檢測RAW264.7細胞增殖。將RAW264.7細胞培養在96孔板中，接種密度為每孔0.5×105個，每組并且設置4個副孔。接種24 h之后，分2組處理。第1組用不同濃度LH（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol∕L）處理 RAW264.7 細胞 48 h。第 2 組用 2.0 μmol∕L LH 處理 RAW264.7 細胞 24、48、72 h。磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞，每孔RAW264.7細胞中加入20 μL的5 mg∕mL MTT試劑，放在細胞培養箱中培養4 h。丟棄MTT溶液，加入200 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液，然后在搖床上搖蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀在490 nm處檢測吸光度值。

1.2.4 Western blotting實驗 取LH干預組（RANKL+LH組）及非LH干預組（RANKL組）細胞，棄掉細胞中培養基，用PBS洗2次。每個小皿加入80 μL裂解液，在冰上裂解 30 min。刮蛋白，離心（13 min、4 °C、13 000 r∕min）收集蛋白裂解液。雙環辛酸（BCA）工作液根據0.5 mg∕mL牛血清蛋白（BSA）制備標準曲線，然后檢測不同處理細胞蛋白濃度。制備上樣蛋白（40 μg）。在8％SDS?PAGE凝膠中分離，之后電轉到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜用5％脫脂牛奶在室溫封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育磷酸化芳香胺N（anti?phospho）?IκBα、anti?phospho?PI3K 和 anti?phospho?Akt抗體，以及非磷酸化的 anti?IκBα、anti?PI3K 和 anti?Akt抗體，甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）用作內參。放置于4℃環境，過夜，PBS洗3次，每次5 min。孵育相應的二抗，PBS洗3次，每次5min，最后增強化學發光法（ECL）顯影。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，實驗數據采用表示，兩組間差異比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TRAP染色 RANKL刺激RAW264.7分化為破骨細胞，TRAP染色陽性為多核破骨細胞。在RAW264.7細胞中，TRAP染色表明，與RANKL組比較，不同濃度LH顯著抑制破骨細胞分化，差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖 1A、B。

圖1 TRAP對RAW264.7細胞進行染色

2.2MTT實驗 MTT實驗表明，LH能夠顯著抑制RANKL誘導的RAW264.7細胞增殖，與對照組（0.0 μmol∕L LH組）比較，其他不同濃度LH組的RAW264.7細胞存活率顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），并且對RAW264.7細胞抑制作用呈時間、劑量依賴性。見圖2A、B。

2.3 Western blotting實驗 Western blotting實驗結果表明，與對照組（0 min）比較，RANKL 顯著上調 p?IκBα表達，尤其是在第10分鐘，差異有統計學意義（P＜0.01）。在相同處理時間（5、10、15 min），與 RANKL 組比較，LH處理之后可以顯著抑制p?IκBα的表達，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖 3A、B。

與對照組（0 min）比較，在RANKL處理5、10 min時，顯著上調p?PI3K和p?Akt表達，差異均有統計學意義（P＜0.05）。在相同處理時間（5、10、15、30、60 min），與RANKL組比較，LH處理之后可以顯著抑制p?PI3K和p?Akt表達，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖 3C、D?1、D?2。

圖2 LH對RAW264.7細胞增殖影響

圖3 LH對相關蛋白表達的影響

3 討 論

LH是基于從益母草中提取的益母草結構。在傳統中醫藥中，益母草是廣泛用于婦科疾病，例如流產之后子宮異常出血[9]、產后出血[10]及痛經[11]。本研究表明，LH能夠明顯抑制RANKL介導的破骨細胞形成。在分子機制水平方面，LH抑制RANKL激活的NF?κB活性，影響IκBα磷酸化和降解，抑制PI3K∕AKT信號通路的激活。

作者用破骨細胞前體RAW264.7研究LH對破骨細胞形成的影響。在骨髓微環境中，RANKL能夠驅使破骨細胞前體分化為成熟破骨細胞[12]，故本研究采用RANKL刺激RAW264.7分化為破骨細胞。而TRAP染色與MTT實驗都表明，LH能夠顯著抑制破骨細胞形成，并且呈劑量、時間依賴性。

核因子κB在RANKL誘導的破骨細胞形成中發揮著重要的作用，缺失核因子κB亞基p50和p52導致骨硬化不能夠形成破骨細胞[13]。PI3K∕Akt信號通路可以被RANKL 激活，從而調節破骨細胞生存和分化[14?15]。而RANKL 誘導的 Akt又是依賴于 TRAF6?Src?PI3K∕Akt的相互作用，故本研究探討了LH對RANKL誘導的RAW264.7細胞中IκBα、PI3K和Akt蛋白磷酸化的影響。結果顯示，RANKL誘導的Akt活性對LH極度敏感，LH抑制RANKL介導的PI3K上調。

本研究結果表明，LH可以通過下調IκBα、PI3K和Akt蛋白的磷酸化，從而抑制IκBα、PI3K和Akt蛋白活性，抑制破骨細胞生成。其可能用于臨床治療破骨細胞相關疾病如骨質疏松癥等。