土壤阿特拉津的生物修復(fù)機(jī)制的研究

藺中 張倩 李文清 魏金華 葉小凡 丘建煒 羅舒文 甄珍

摘 要：阿特拉津主要用于一年生禾本科雜草和闊葉雜草的防除，由于其成本低、除草效果好，已迅速在世界范圍內(nèi)廣泛使用。阿特拉津不易降解，在環(huán)境中持留時(shí)間長(zhǎng)，頻繁使用會(huì)污染農(nóng)田土壤及周圍水體，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生威脅。環(huán)境中的微生物種類基數(shù)大，容易異變，適應(yīng)能力強(qiáng)，生物降解因具有高效、成本低，無二次污染的優(yōu)點(diǎn)而成為研究的焦點(diǎn)。文章運(yùn)用穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)（SIP）與各種分子生物學(xué)手段結(jié)合，展望了同位素探針技術(shù)在鑒定降解有機(jī)污染物的功能菌方面的前景。

關(guān)鍵詞：阿特拉津 生物修復(fù) 降解菌 穩(wěn)定同位素探針技術(shù)

中圖分類號(hào)：X53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2018）04（b）-0116-03

1 阿特拉津的概述

1.1 阿特拉津的性質(zhì)

阿特拉津是一種選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗前苗后除草劑，常用于玉米、甘蔗、高粱和林地等。阿特拉津化學(xué)名稱為氯乙異丙嗪（2-氯-4-乙氨基-6-異丙氨基-1，3，5-三嗪），是一種均三氮苯類農(nóng)藥，分子式為C8H14ClN5，分子量為215.68，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

阿特拉津在微酸及微堿介質(zhì)中較為穩(wěn)定，其純品為白色粉末，原粉純度在92%以上，熔點(diǎn)為173-175 ℃，沸點(diǎn)為200 ℃，20 ℃時(shí)蒸氣壓為4.0×10-5 Pa，。25 ℃時(shí)在水中的溶解度為33 mg·L-1，醋酸乙酯中為28000 mg·L-1，二乙醚中為2000 mg·L-1，正戊烷中為360 mg·L-1，甲醇中為18000 mg·L-1[1]。

1.2 阿特拉津的危害

阿特拉津在全球大范圍使用已有40余年的歷史，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響。阿特拉津的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易降解，半衰期為8～52周，被微生物代謝分解的過程緩慢。同時(shí)具有廣譜毒性和生物累積性，是一種典型的含氯原子致畸、致癌、致突變的“三致”污染物。

阿特拉津主要通過根部和葉片進(jìn)入植物體內(nèi)，大部分農(nóng)作物，如水稻、小麥、黃瓜、大白菜、甘藍(lán)等對(duì)阿特拉津較為敏感，當(dāng)灌溉水中的濃度達(dá)到0.1 mg/L時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生藥害作用。他還可以通過食物鏈在動(dòng)物體內(nèi)傳遞積累，從而危害人體健康。有研究表明，阿特拉津可能引發(fā)人體細(xì)胞發(fā)生癌變，長(zhǎng)時(shí)間接觸會(huì)增大乳腺癌及卵巢癌的發(fā)生機(jī)率，同時(shí)影響人類心血管系統(tǒng)和再生繁殖。因此，阿特拉津已經(jīng)被列入環(huán)境荷爾蒙的可疑物質(zhì)并于2017年10月被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列入到3類致癌物清單中。

綜上所述，阿特拉津是一種殘留時(shí)間長(zhǎng)、藥害大、污染嚴(yán)重，對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅的除草劑。

1.3 阿特拉津的治理方法

目前阿特拉津污染的治理主要有物理法、物理化學(xué)法和生物修復(fù)法。物理處理方法不會(huì)改變阿特拉津的性質(zhì)，污染物不僅不能從根本上得到去除，還會(huì)產(chǎn)生含污染物的活性炭、污泥等，造成環(huán)境二次污染，所以物理處理法較少應(yīng)用于環(huán)境實(shí)際修復(fù)中。物理化學(xué)法降解阿特拉津有光解法、水解法以及氧化還原降解法。該方法存在運(yùn)行成本高、耗能高、設(shè)備復(fù)雜、降解物成為二次污染物等諸多不足，故目前仍處于實(shí)驗(yàn)室模擬階段，難以大面積推廣。

微生物修復(fù)技術(shù)是一種利用污染土壤的土著微生物或向環(huán)境中加入人工培養(yǎng)馴化的具有某種特定功能的微生物，在適宜的生長(zhǎng)條件下，通過自身的同化作用，分解環(huán)境中的污染物。從而達(dá)到降低環(huán)境中有害污染物活性或?qū)⑽廴疚锝到獬蔁o害物質(zhì)的修復(fù)技術(shù)。微生物修復(fù)操作簡(jiǎn)單，處理成本低，且不會(huì)產(chǎn)生對(duì)環(huán)境有害的副產(chǎn)物，具有較高的安全性和清潔性。故該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中得以廣泛推廣，受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。環(huán)境中的微生物種類多、繁殖快，適應(yīng)能力強(qiáng)，易變異，同時(shí)具有較強(qiáng)的吸收轉(zhuǎn)化能力，目前已有許多學(xué)者從環(huán)境中獲得并鑒定了一些具有降解阿特拉津功能的微生物。

1.4 阿特拉津降解菌

目前報(bào)導(dǎo)的通過實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)、分離純化和誘變等手段獲得的可以降解阿特拉津的功能微生物主要有細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類四大類。

目前發(fā)現(xiàn)的具有降解阿特拉津的細(xì)菌和放線菌主要有假單胞菌、紅球菌、節(jié)桿菌屬、根瘤菌屬、蠟狀芽孢桿菌、藤黃微球菌屬、土壤桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、微小桿菌屬、諾卡氏菌屬、和黃單胞菌屬等。假單胞細(xì)菌是目前發(fā)現(xiàn)能夠礦化阿特拉津的最主要微生物，它在阿特拉津的礦化過程中起著重要作用。

能夠降解阿特拉津的真菌有曲霉屬、青霉屬、根霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬、白腐菌和酵母屬等。其中白腐真菌具有較高的氧化降解能力，可降解多種環(huán)境污染物。曲霉屬和青霉屬主要通過脫烷基作用降解阿特拉津。藻類有衣綠藻屬、纖維藻和月牙藻等[2-3]。

2 阿特拉津的生物降解

2.1 生物降解的鑒定方法

科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，使鑒定土壤微生物多樣性的技術(shù)不斷改進(jìn)和完善。目前生物降解的鑒定方法有：稀釋平板法、以分子指紋圖譜為基礎(chǔ)的鑒定方法、高通量測(cè)序和穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)。稀釋平板法是在人為添加特定碳氮源或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上，有選擇性地富集、分離和純化所需的微生物。由于只有0.1%～1%的土壤微生物種群可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因而無法全面地鑒別土壤環(huán)境中微生物的種群構(gòu)成。以分子指紋圖譜為基礎(chǔ)的鑒定方法有變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresi，DGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）和限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）。DGGE、T-RFLP等分子生物學(xué)技術(shù)不僅可以使人們可以從表型特征研究微生物，而且可以從整個(gè)微生物界的基因群特征進(jìn)行分類鑒定，使人們對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的認(rèn)識(shí)得到了提高，但仍不易得到有關(guān)微生物間相互作用及功能微生物的直接信息。高通量測(cè)序（High-throughput sequencing，HTS）又稱“下一代測(cè)序”，能一次測(cè)定幾十萬到幾百萬條DNA分子序列和一般讀長(zhǎng)較短等。該技術(shù)能夠同時(shí)分析數(shù)以百計(jì)的不同環(huán)境樣品，不僅對(duì)揭示微生物的遺傳信息和基因表達(dá)調(diào)控起著重要作用，而且在研究復(fù)雜環(huán)境中微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化關(guān)系和功能活性等及反映環(huán)境中非優(yōu)勢(shì)、低豐度的重要污染物降解菌的功能日益突出。穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)（Stable isotope probing，SIP）將穩(wěn)定性同位素標(biāo)記和分子生物學(xué)手段相結(jié)合，在自然環(huán)境樣品中加入富含穩(wěn)定同位素的標(biāo)志的營(yíng)養(yǎng)液，原位樣品中的微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以合成自身生長(zhǎng)發(fā)育所需的物質(zhì)，通過分離鑒定可以研究微生物的功能及種群構(gòu)成，實(shí)現(xiàn)了將微生物間相互關(guān)系及其代謝途徑與微生物種群結(jié)合起來的目的[2，4，5]。

2.2 同位素探針的應(yīng)用

同位素探針技術(shù)主要應(yīng)用于甲基氧化細(xì)菌、多碳混合物、微生物碳氮循環(huán)過程、宏基因組、原位鑒定有機(jī)污染物降解等的研究。其在有機(jī)污染物生物降解的運(yùn)用主要集中于單環(huán)芳香烴（BTEX）、多環(huán)芳烴（PAHs）和多氯聯(lián)苯（PCBs）的研究。

用生物修復(fù)手段降解環(huán)境中的單環(huán)芳香烴類化合物較為容易，Hanson等首次使用13C標(biāo)記的甲苯，結(jié)合磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）和SIP技術(shù)研究了甲苯的微生物降解，發(fā)現(xiàn)土壤中16種被13C標(biāo)記的 PLFA 與傳統(tǒng)方法培養(yǎng)分離的能降解甲苯的功能菌的PLFA相同，證明了復(fù)雜環(huán)境中特定化合物的降解代謝可以運(yùn)用PLFA-SIP技術(shù)探查。目前，越來越多的學(xué)者應(yīng)用DNA-SIP技術(shù)研究環(huán)境中能降解BTEX的微生物。Pele等用此技術(shù)探測(cè)到降解甲苯的厭氧微生物的數(shù)量[6]。Manefield和Whiteley等用RNA-SIP技術(shù)確定工業(yè)反應(yīng)堆中能代謝苯酚的厭氧細(xì)菌。Aburto等也用RNA-SIP技術(shù)研究地下水中能降解苯的功能微生物。

PAHs是一類具有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的有機(jī)化合物，是許多微生物的唯一碳源。實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的單污染物降解菌的降解途徑已相當(dāng)清晰，但環(huán)境往往有多種PAHs，因此需同時(shí)研究和鑒定污染土壤中多種PAHs降解菌。Zhang等、Martin等和Gutierrez等運(yùn)用DNA-SIP分別從污染水體底泥、海水中鑒定出蒽降解菌和萘降解菌。Johnsen等在4種污染土壤中進(jìn)行原位試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得PLFA圖譜找出了土壤中能夠降解菲的細(xì)菌。羅春玲等人運(yùn)用DNA-SIP技術(shù)識(shí)別了土壤中菲的降解菌，首次發(fā)現(xiàn)Collimonas屬的微生物具有降解PAHs的能力，Terrimonas屬微生物可以降解土壤中BaP[7]。

PCBs在環(huán)境中分布廣、毒性大、殘留量高。起初研究其降解菌主要運(yùn)用PLFA-SIP技術(shù)和DNA-SIP技術(shù)。Tillmann等用13C全標(biāo)記二氯聯(lián)苯，應(yīng)用PLFA-SIP技術(shù)鑒別污染物生物膜中的PCBs降解菌，發(fā)現(xiàn)降解二氯聯(lián)苯的功能菌為數(shù)量較少的伯克氏菌屬，而非在體系中處于優(yōu)勢(shì)地位的甲基桿菌屬。Uhlik等結(jié)合DNA-SIP技術(shù)和T-RFLP技術(shù)研究多氯聯(lián)苯污染土壤和山葵根際的微生物，發(fā)現(xiàn)兩種不同土壤降解菌種類均不同[2]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)往PCBs污染土壤中加入芳香烴培養(yǎng)一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)土壤中能代謝多氯聯(lián)苯的菌也能同化萘。

因此，SIP技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合揭示了復(fù)雜土壤環(huán)境中參與降解有機(jī)污染物的功能微生物的種類、起作用的功能基因及其之間的相互作用，這對(duì)于功能微生物的鑒定和發(fā)展起到了巨大的作用。

3 研究展望

隨著人們對(duì)環(huán)境問題的重視，用于研究生物降解機(jī)理的技術(shù)手段不斷被研發(fā)。穩(wěn)定同位素探針技術(shù)具有高效準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，為微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域提供了大量的信息，為獲得相關(guān)功能微生物及其功能基因方面的信息，研究有機(jī)污染物生物修復(fù)和生物降解途徑提供了重要的工具，同時(shí)在探查土壤環(huán)境功能微生物群落和土壤環(huán)境中植物、動(dòng)物、細(xì)菌和真菌在降解污染物中的綜合作用有重要意義。

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