嵌合抗原受體修飾T細胞（CAR-T細胞）制劑制備質量管理規范

中國醫藥生物技術協會

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編者按

免疫細胞治療是近年來腫瘤治療的重點發展領域，其在臨床研究中顯示出良好的應用前景，給腫瘤患者帶來了新的希望，成為學術界和產業界共同關注的焦點。其中嵌合抗原受體 T 細胞免疫療法（CAR-T 療法）因其在血液系統腫瘤的治療中展現出顯著效果而成為臨床研究的熱點。在免疫細胞治療研究的管理方面，中國醫藥生物技術協會于 2016 年制定頒布了《免疫細胞制劑制備質量管理自律規范》，為免疫細胞臨床研究的規范化開展奠定了基礎。然而，CAR-T 細胞作為一類特殊的免疫細胞，其制備和質量控制具有一定的特殊性，需遵循相關原則以保證 CAR-T 制劑的安全性和生物學效應。

目前各機構在 CAR-T 細胞制劑制備方面仍存在較大的差距，2017 年國家食品藥品監督管理總局發布了《細胞治療產品研究與評價技術指導原則》，2018 年中國食品藥品檢定研究院發布了《CAR-T 細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》，為 CAR-T 細胞制劑的制備提供了一定的技術指導。遵循《藥品生產質量管理規范》（GMP）是 CAR-T 細胞制劑制備的原則要求，如何幫助機構正確理解 GMP 的基本原則，并將其應用于 CAR-T 細胞制劑制備之中，進一步加強 CAR-T 細胞治療的質量管理，規范細胞制備過程并保證 CAR-T 細胞制品在臨床研究和應用時的質量，是當前需要解決的重要問題。

自 2016 年 12 月開始，中國醫藥生物技術協會組織業內骨干醫療單位及專家參照 GMP、《免疫細胞制劑制備質量管理自律規范》、《細胞治療產品研究與評價技術指導原則》和《CAR-T 細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》等相關規定和指導原則，以及國外相關組織的同類指南，啟動了《嵌合抗原受體修飾 T 細胞（CAR-T 細胞）制劑制備質量管理規范》（以下簡稱《CAR-T 規范》）的起草工作，歷時一年零九個月，期間幾易其稿，組織大小研討會十余次，經反復修改后形成了目前的《CAR-T 規范》。本規范提出了制備機構開展 CAR-T 細胞制劑制備應該遵守的基本要求，以及制劑制備各個環節的質量要求，旨在幫助制備機構能夠持續穩定地制備出符合質量標準的CAR-T 細胞制劑，同時，該規范的實施情況也可作為機構開展 CAR-T 細胞制劑制備能力評價的依據。

該規范由中國醫藥生物技術協會醫藥生物技術臨床應用專業委員會牽頭起草。在規范起草過程中，天津醫科大學腫瘤醫院、北京博仁醫院、安徽未名細胞治療有限公司等單位積極參加編寫并提供了大力支持，中國食品藥品檢定研究院孟淑芳研究員給予了悉心指導，在此一并致謝，同時感謝在規范起草過程中參與討論并給予意見的醫療單位、企業以及專家們。

中國醫藥生物技術協會

嵌合抗原受體修飾T細胞（CAR-T細胞）制劑制備質量管理規范

中國醫藥生物技術協會

目 次

前言……………………………………………………………………………………………………………… 388

引言……………………………………………………………………………………………………………… 388

1 范圍………………………………………………………………………………………………………… 389

2 規范性引用文件…………………………………………………………………………………………… 389

3 術語和定義………………………………………………………………………………………………… 389

4 基本原則…………………………………………………………………………………………………… 390

4.1 總體要求……………………………………………………………………………………………… 390

4.2 人員…………………………………………………………………………………………………… 390

4.3 物料…………………………………………………………………………………………………… 390

4.4 設施和設備…………………………………………………………………………………………… 391

5 載體制備…………………………………………………………………………………………………… 391

5.1 質粒制備……………………………………………………………………………………………… 391

5.2 非病毒載體制備……………………………………………………………………………………… 391

5.3 病毒載體制備………………………………………………………………………………………… 391

6 CAR-T 細胞制備及質量控制…………………………………………………………………………… 392

6.1 T 細胞的采集和分離………………………………………………………………………………… 392

6.2 CAR-T 細胞制備…………………………………………………………………………………… 392

6.3 CAR-T 細胞制劑的質量控制……………………………………………………………………… 393

6.4 CAR-T 細胞凍存、運輸與復蘇…………………………………………………………………… 393

6.5 CAR-T 細胞制劑的放行…………………………………………………………………………… 393

7 追溯……………………………………………………………………………………………………… 394

8 保密……………………………………………………………………………………………………… 394

參考文獻……………………………………………………………………………………………………… 394

前 言

本標準按照GB/T 1.1—2009《標準化工作導則 第1 部分：標準的結構和編寫》給出的規則起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別這些專利的責任。

本標準由中國醫藥生物技術協會制定，由中國醫藥生物技術協會實施。

本標準起草單位：中國醫藥生物技術協會醫藥生物技術臨床應用專業委員會、天津醫科大學腫瘤醫院、北京博仁醫院、安徽未名細胞治療有限公司。

本標準主要起草人：任秀寶、孫倩、童春容、劉振云、孫艷、王偉、郝希山。

本標準為首次發布。

引 言

近年來，免疫治療經歷了一系列突飛猛進的發展，以特異性過繼免疫細胞療法及免疫檢查點抗體療法為代表的新型免疫治療技術因其在臨床研究中取得的顯著療效而成為學術界和產業界共同關注的焦點。其中，嵌合抗原受體 T 細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T 療法）因其在白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤等病種的治療中展現出顯著的治療效果而成為國內外研究的熱點。隨著我國對 CAR-T 技術的研究不斷深入，國內企業的積極布局和產業鏈的延伸，我國的CAR-T細胞治療技術也在緊隨國際趨勢的發展。

遵循《藥品生產質量管理規范》（GMP）是 CAR-T 細胞制劑制備的原則要求。此前，中國醫藥生物技術協會已經制定了《免疫細胞制劑制備質量管理自律規范》，幫助機構在免疫細胞制劑制備過程中避免污染、交叉污染、混淆及差錯，最大限度地保證免疫細胞制劑的安全性、生物學效應。但 CAR-T 細胞作為一類特殊的免疫細胞，其制備和質量控制具有特殊性。為了適應我國 CAR-T 細胞治療產業的需要，加強 CAR-T 細胞治療的質量管理，規范細胞制備過程，保證 CAR-T 細胞制劑在臨床研究和應用時的質量，促進國內外同行間的交流，中國醫藥生物技術協會在已有《免疫細胞制劑制備質量管理自律規范》的基礎上，根據 CAR-T 細胞的特殊性，制定《CAR-T 細胞制劑制備質量管理規范》。CAR-T 細胞制劑制備過程中涉及到的人員、設備、樣品儲存與運輸、標識與追溯系統等其他要求，應參照中國醫藥生物技術協會制定的《免疫細胞制劑制備質量管理自律規范》執行。

1 范圍

1.1 本標準規定了CAR-T 細胞制劑制備機構在制備過程中包括從載體制備、細胞采集以及細胞轉導/轉染、擴增、收集、凍存等過程中須遵循的基本要求和原則，保證CAR-T 細胞制劑的安全性和生物學效應。

1.2 本標準適用于CAR-T 細胞制劑制備的所有階段。

2 規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

《中華人民共和國藥典》（三部）

《免疫細胞制劑制備質量管理自律規范》（中生協字〔2016〕035 號）

3 術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

嵌合抗原受體 T 細胞（CAR-T 細胞） chimeric antigen receptor T cell, CAR-T cell

經過基因工程修飾的，可表達被導入的含有抗原識別片段、T 細胞受體活化分子、共刺激信號等信號分子的CAR 基因的T 細胞。

3.2

外周血單個核細胞 peripheral blood mononuclear cell, PBMC

血液中具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和少量其他細胞類型。

3.3

質粒 plasmid

一類存在于細菌和真菌細胞中獨立于染色體DNA 而自主復制的共價、閉合、環狀DNA 分子，通常攜帶一定數量的基因，是基因工程最常見的運載體。

3.4

目的基因 target gene

人工構建的具有明確功能的基因或基因片段。

3.5

載體 vector

在基因工程重組DNA 技術中將DNA 片段（目的基因）轉移至受體細胞中進行復制和表達的工具。

注：常用的載體包括質粒、病毒等。

3.6

轉導 transduction

借助病毒等方法將外源性遺傳物質（DNA 或RNA）導入細胞進行表達的過程。

3.7

轉染 transfection

通過非病毒載體（如質粒）將外源遺傳物質（DNA 或RNA）植入細胞的過程。

3.8

凍存液 cryoprotectant

能保護細胞在冷凍和復蘇過程不受損害的溶液或試劑。

3.9

標識 label

粘貼或附著在對象上的用于區分不同對象的標記、注釋或條碼。

3.10

細胞批次 cell batch

取自個體的細胞經單次細胞制備工藝過程制成的一批細胞制劑。

4 基本原則

4.1 總體要求

CAR-T 細胞制劑的制備包括質粒的制備、病毒的制備、樣本的采集、接收、處理、細胞刺激、轉導/轉染、擴增、收獲、質量檢測、凍存和運輸等全過程。制備機構應建立健全CAR-T 細胞制劑制備的質量管理體系，結合CAR-T 細胞制劑制備的特殊工藝，對各個操作環節以及環境和人員等嚴格要求并實施，最終產品應符合質量標準。

4.2 人員

4.2.1 制備機構應配備與其規模相適應的CAR-T 細胞制劑制備人員和質量檢測人員，操作人員應具備基本的專業知識，并接受特定的專業技術培訓后方可上崗。病毒和細胞制備技術人員身體健康無傳染性疾病，能熟練掌握無菌操作技能，并具備病毒制備或人免疫細胞培養經驗，其職稱、學歷、經歷、資格證書、繼續教育與健康記錄，應建檔保存。

4.2.2 建立人員衛生操作規程和自我防護規程，最大限度地降低人員對細胞制備造成污染以及操作人員自我感染的風險。操作規程應包括與健康、衛生習慣及人員著裝相關的內容，以及操作過程中避免交叉污染和污物正確處理方法等內容。

4.3.2 維修人員或其他非專業人員進入制備區和質控區應經過培訓和批準。

4.3 物料

4.3.1 CAR-T 細胞制劑制備所用的物料是指制備中所使用的試劑耗材、生物活性因子以及與細胞制劑直接接觸的包裝材料及外包裝材料等。

4.3.2 CAR-T 細胞制劑制備所用的樣本及物料應符合相應的質量標準。進口物料應符合國家相關的進口管理規定。細胞制劑制備中使用的物料管理應參照《中華人民共和國藥典》中的《生物制品生產用原材料及輔料質量控制規程》實行管理。物料供應商應有相應的資質，并提供證明文件。

4.3.3 培養過程中對培養基、活性因子等外源蛋白的要求如下：

a) 所有使用的培養基、活性因子等外源蛋白應有明確的來源及批號，應有質量檢定合格報告；

b) CAR-T 細胞體外擴增培養應盡量避免動物或人源物質如血清等制品的使用，若必須使用，需要開展相關研究，證明使用的必要性和合理性；嚴禁使用疫病流行區來源和未經過安全性驗證的動物血清等制品。

4.3.4 轉導/轉染過程中所使用的培養皿或培養袋等耗材和細胞因子等均需符合相應的質量標準。

4.3.5 制備機構應建立物料檢驗和放行質量標準，對生物活性試劑，制備機構應有相應措施確定有效期和保存條件，并在有效期內使用。

4.3.6 制備機構自制的試劑（如血漿、抗原等），應建立質量標準、編號及批號的編制操作規程，并經檢驗合格后使用，每種物料均應編制唯一的編號，并有制備記錄。

4.4 設施和設備

4.4.1 CAR-T 細胞制劑制備場所按照不同工藝應至少包括質粒制備區、病毒制備區、細胞制備區，質控區（支原體測定、內毒素測定、流式細胞儀檢測和分子生物學等相關檢測）和儲存區（病毒儲存區、細胞儲存區），各個區域應相對獨立。病毒制備區、病毒儲存區應具有獨立的空調系統。制備機構可根據實際情況合理分配和增加所需區域（留樣室、辦公室、資料檔案室、物料儲存室、氣體儲存室等）。

4.4.2 制備機構應根據工藝要求，對各功能區合理設計、布局和使用，應設立潔凈區，潔凈區的設計、建設、管理、進出、使用、清潔、消毒、環境檢測等參見藥品GMP 規范無菌藥品附錄。

4.4.3 載體的制備應在C 級背景下A 級潔凈度級別的環境中進行，載體在非密閉條件下的除菌過濾和灌裝應在B 級背景下A 級潔凈度級別的環境中進行；CAR-T 細胞制劑制備過程中與細胞有關的操作，如細胞分離、轉導/轉染、擴增、收獲等應在非密閉條件下的操作應在B 級背景下A 潔凈度級別的環境中進行。

4.4.4 制備機構應設置用于制備感染性樣本的獨立物理空間，設立獨立的空調系統。使用后的器具和相關物品應經過滅活處理后再移出該區域。感染性樣本與非感染性樣本的處理及制備不得使用同一設備。

5 載體制備

5.1 質粒制備

5.1.1 質粒應序列信息明確，并經過鑒定和確認。質粒菌種應采取種子庫系統，并按照《中國藥典》相關要求完成菌種庫的檢定。菌種建庫過程應符合藥品GMP 規范，同時應有明確來源和批次信息，并有詳細記錄。

5.1.2 質粒的質量應經過檢測，包括但不限于：

a) 純度：超螺旋型的含量，細菌基因組DNA、RNA和蛋白殘留量；

b) 無菌試驗；

c) 內毒素試驗；

d) 酶切鑒定；

e) 基因測序；

f) 如工藝中使用有潛在危險性的物質，則需做物質殘余量的測定。

5.2 非病毒載體制備

非病毒載體（包括但不限于DNA、RNA、蛋白質）應有明確的來源、結構和遺傳特性，制備過程應符合藥品GMP 標準，達到相應質量標準的要求。不得含有支原體、細菌及病毒等其他任何外源因子，內毒素應控制在限定范圍內；根據所選擇載體類型不同，參見《細胞治療產品研究與評價技術指導原則》（試行）、《人基因治療研究和制劑質量控制技術指導原則》、《人用重組DNA 制品質量控制技術指導原則》、《人用單克隆抗體質量控制技術指導原則》等。

5.3 病毒載體制備

5.3.1 病毒包裝細胞系應采取種子庫系統，建立主細胞庫和工作細胞庫，并按照《中國藥典》相關要求完成細胞庫的檢定。細胞建庫過程應符合藥品GMP 規范，有明確來源和批次信息，并有詳細記錄。

5.3.2 病毒包裝所用細胞系的細胞培養液應成分明確并具有溯源性，使用人或動物源性成分，如血清、胰蛋白酶或其他生物學活性物質，應具有這些成分的來源、批號、質量控制、檢測結果和質量保證的相關信息，應不得含有任何病毒等外源因子。

5.3.3 每一批用于轉導/轉染的病毒應經過檢測，包括但不限于：

a) 鑒別試驗；

b) 復制型病毒（RCR/RCL）檢測（生產時的批次和凍存復蘇時的批次）；

c) 無菌試驗；

d) 內毒素檢測；

e) 支原體檢測；

f) 殘留量測定：應根據生產工藝及成品的添加成分，對有潛在危險性的成分進行殘留量檢測；

g) 病毒滴度測定；

h) 效力試驗：插入基因的表達水平測定及生物學活性測定。

5.3.4 應避免病毒載體反復凍融，病毒應儲存于合適的環境中并進行穩定性研究，確定使用期限并在有效期限內使用。每批病毒應編制唯一的批號，并建立病毒的出入登記記錄制度。

6 CAR-T 細胞制備及質量控制

6.1 T 細胞的采集和分離

6.1.1 制備機構應建立供者采集標準，進行細胞采集應具備相應的資質，應使用全自動血細胞分離機，按單核細胞分離程序，采集外周單個核細胞富集血，在技術上無法實現采集外周血單個核細胞富集血的情況下，可考慮靜脈血采集方案。根據制備要求對采集的外周血進行單個核細胞的分離及T 細胞的分選，并對所分選出的T 細胞進行活化。

6.1.2 采集管路應使用一次性消耗品，血細胞分離機應定期進行清潔和檢測。

6.1.3 在符合潔凈級別要求的操作間分離PBMC，根據工藝要求再進一步確定是否分選特定細胞亞群進行轉導/轉染，轉導/轉染前進行細胞計數及細胞存活率測定。

6.1.4 傳染性病毒檢測陽性患者的T 細胞應在感染性樣本制備區進行細胞分離、培養、收集，完成制備過程。操作完畢應徹底清場、并應驗證確認無該次操作殘留感染風險物后方可進行后續供者的樣品制備。

6.2 CAR-T 細胞制備

6.2.1 樣本送達時應附細胞制備申請單，內容包括但不限于：

a) 患者姓名縮寫、篩選號或入組編號或其他唯一識別碼；

b) 患者臨床診斷，腫瘤特異性靶點信息；

c) 實驗室檢測的結果：血常規及分類、HIV、HCV、HBV、EBV、CMV、HTLV、梅毒、肝腎功能、凝血檢測；如果是異體治療回輸，應做ABO 血型、Rh 血型配型以及HLA 配型檢測；

d) 治療方案：細胞的種類、治療次數、回輸方式等；

e) 知情同意書。

6.2.2 CAR-T 細胞制劑制備應按照經過驗證后批準的操作規程的要求進行，并有相關記錄。

6.2.3 在感染性樣本操作區內，操作人員應穿戴該區域專用的防護服。

6.2.4 在細胞培養耗材及培養箱上進行標識，并采取措施避免交叉污染。

6.2.5 操作前應檢查所領用的包裝材料正確無誤，核對包裝產品和所用包裝材料的名稱、規格、數量、質量狀態，且與操作規程相符。

6.2.6 活化T 細胞所采用的包被抗體或磁珠抗體應符合相關質量要求。

6.2.7 細胞轉導/轉染主要包括非病毒轉染和病毒轉導兩種方式，應確認基因導入系統并對其進行驗證，建立關鍵步驟控制點。

6.2.8 細胞擴增過程中每更換一次培養體系應準確計數，應根據質量要求對細胞濃度及培養時間進行調整。

6.2.9 CAR-T 制劑的收獲分為新鮮劑型和凍存劑型，凍存宜采用全封閉凍存袋的方式，在氣相液氮儲存環境下儲存。

6.2.10 每批次細胞培養結束后，應進行清場，制備場所和設備應沒有與本次制備有關的物料、產品、記錄等遺留。

6.2.11 應建立CAR-T 細胞制劑批號編制規程。每批細胞制劑應編制唯一的批號，并建立出入登記記錄制度。

6.2.12 應避免出現任何偏離工藝規程或操作規程的偏差，如出現偏差，應按照偏差處理操作規程執行。

6.2.13 制備機構應建立CAR-T 細胞制劑留樣操作規程，留樣應至少保存至使用結束后三個月。

6.3 CAR-T 細胞制劑的質量控制

6.3.1 制備機構應具有CAR-T 細胞制劑的檢測能力，并配備相關專業技術人員和設備，建立制劑質量標準，確立制劑質量檢驗操作規程，所有檢測方法應經過驗證。

6.3.2 CAR-T 細胞制劑的質量要求：

a) 應進行無菌試驗和支原體檢測；

b) 應進行內毒素檢測；

c) 應對細胞存活率和回輸數量進行檢測；

d) 應對終產品中CAR-T 細胞轉導/轉染率、免疫表型進行檢測；

e) 應檢測CAR-T 細胞制劑對特異性腫瘤細胞的殺傷作用；

f) 病毒轉導/轉染后的細胞應進行RCR/RCL 檢測；

g) 應進行CAR-T 細胞的基因拷貝數檢查（VCN）；

h) 對于培養后不經凍存，直接回輸的CAR-T 制劑，應加強培養的全過程質量控制，設置合理的取樣點，并采用合理的快速檢測方法進行質量控制；

i) 如果細胞培養基內添加成分可能會對細胞制劑質量或安全性產生影響，應對培養基及其他添加成分殘余量進行檢測，如細胞因子等；

j) 使用磁珠抗體刺激T 細胞的，應檢測制劑中的殘余磁珠量。

6.3.3 制備機構應在CAR-T 細胞制劑制備過程中開展質量檢測，制劑的檢驗應由制備機構負責人指定有資質的人員進行。制備機構可以委托有資質的第三方開展相關質量檢測。檢測結果應有質量負責人或質量受權人簽字審核。

6.4 CAR-T 細胞凍存、運輸與復蘇

6.4.1 制備機構應建立CAR-T 細胞的凍存和復蘇操作規程，在規定的溫度范圍內儲存細胞。應對凍存工藝（包括凍存液和凍存容器等）和復蘇工藝進行驗證，驗證項目宜包括生物學效力、細胞純度、細胞特性、活細胞數及比率、功能細胞數和安全性相關的內容等。

6.4.2 應建立CAR-T 細胞制劑運輸的標準操作規程、運輸方式等應經過驗證。

6.5 CAR-T 細胞制劑的放行

6.5.1 制備機構應建立CAR-T 細胞制劑放行的操作規程，符合質量標準的CAR-T 細胞制劑由質量管理負責人或質量受權人批準后方可放行。

6.5.2 CAR-T 細胞制劑經放行后方可進行回輸。

6.5.3 每批次的CAR-T 細胞制劑放行檢測項目應至少包括：無菌檢測、支原體檢測、內毒素檢測、細胞存活率、細胞數量、非T 細胞表型、效應細胞比率、CAR 轉導/轉染效率、CAR 基因拷貝數、復制型

病毒以及可能的毒性物質殘留等。

6.5.4 如CAR-T 細胞制劑質制備后需立即進行回輸，可采用經過驗證的快速檢測方法。但應建立規程，規定采用快速檢測方法放行后，使用現行通用檢測方法檢驗出現不合格結果時采取的措施。

7 追溯

7.1 應建立完整的細胞制備記錄系統、標識標簽系統和免疫細胞制劑編碼系統，以便于CAR-T 細胞制劑的辨識并防止制劑混雜。記錄和標識應遵循相關法律和規范的要求。

7.2 細胞制備記錄包括每天的細胞狀況、細胞數量、轉導/轉染條件、細胞因子濃度等具體信息。標識系統應記錄患者信息、細胞制劑名稱、批號、收獲日期及時間、規格（細胞數量/體積）、儲存條件、效期等。

7.3 每個患者的信息和操作全過程應雙人復核。

7.4 每份CAR-T 細胞制劑應編制唯一的編碼。編碼應能追溯到患者信息以及該細胞制劑操作和最終處理的所有記錄。應建立相關程序保證新舊編碼能夠關聯。

7.5 轉移和運輸記錄應能追溯CAR-T 細胞制劑從一個機構到另一個機構的流轉過程。轉移和運輸記錄應包括：CAR-T 細胞制劑發放和接收的日期和時間、運輸過程中的任何延誤或其他突發狀況引起的問題及相應的處置記錄。

7.6 制備機構應建立不良反應報告和收集制度，在對不良反應進行分析時，應能追溯到所使用CAR-T 細胞制劑制備的相關記錄。

8 保密

37應采取措施，防止病人的隱私信息被泄露。

[1] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. 藥品生產質量管理規范(2010年修訂)(衛生部令第79號). 2011-01-17.

[2] 國家食品藥品監管管理總局. 細胞治療產品研究與評價技術指導原則(試行). 2017-12-18.

[3] 中國食品藥品檢定研究院. CAR-T細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點. 中國藥事, 2018, 32(6):829-852.

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.001