MPTP模型小鼠中Th17及其炎癥因子的作用研究

方杰 呂哲 劉嘉音 王琛 洪甘濟 鄭良城 馬琪林

帕金森病(Parkinson disease, PD)是僅次于阿爾茲海默病的世界第二大退行性疾病［1］。其主要病理特點為黑質紋狀體多巴胺(dopamine, DA)能神經元選擇性、漸進性的變性缺失, 膠質細胞增生和細胞胞內路易氏小體(Lewy body)形成［2］。病因機制仍不完全清楚, 其中免疫炎癥機制在其發病過程中起著重要的作用［3］。CD4++Th淋巴細胞亞群Th17細胞參與了許多中樞神經系統疾病的發生和發展［4］, 在PD模型中,N-α-synuclein可刺激Th17相關基因的高表達, 誘導Th17分化, 促進炎癥級聯反應, 從而介導多巴胺能神經元的損傷［5］。本研究應用MPTP小鼠模型, 研究Th17特異性轉錄因子RORγt和特異性炎癥因子IL-17對PD的作用, 進一步明確Th17在PD中的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇14～15周齡、雄性、體重(27±2)g的C57BL/6小鼠, 常規飼養于廈門大學實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 PD模型構建 將48只C57BL/6小鼠隨機分為PD模型組和對照組, 每組24只。PD模型組：造模第1天按照MPTP 20 mg/(kg·次), 每次間隔2 h, 腹腔注射4次。對照組：同樣的方法按照0.05 ml/次注射生理鹽水。兩組小鼠均在造模第2天開始, 連續腹腔注射生理鹽水7 d, 0.2 ml/(次·d)。

1.2.2 行為學檢測 小鼠行為學檢測轉棒儀速度設置為5 min內從4 r/min逐漸增加到40 r/min, 每次檢測間隔5 min,連續測3次取平均值。

1.2.3 中腦黑質TH免疫化學染色 實驗小鼠進行行為學檢測后, 每組各取小鼠6只進行取材。取出中腦常規處理后以12 μm冠狀位連續冰凍切片, 室溫封閉30 min, 1∶200比例稀釋的抗TH兔多克隆抗體覆蓋, 孵育48 h。再次洗滌后將1∶200比例稀釋的FITC標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體滴入切片上, 孵育6 h。洗滌后封片, 后將片子熒光正置顯微鏡下觀察, 計數每只小鼠10張切片的TH陽性神經元數目。

1.2.4 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 法檢測外周血IL-17的表達 行為學實驗后的小鼠每組取6只常規處理后進行眼球取血制備血清樣本。復孔加入100 μl梯度稀釋的標準品, 樣本孔加入20 μl的樣本和80 μl的1×檢測緩沖液, 并在每孔中加入50 μl稀釋后的檢測抗體, 室溫下孵育1.5 h。洗滌后每個微孔中加入100 μl稀釋后的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素, 孵育30 min。再次洗滌后每孔加入100 μl的底色顯物TMB, 室溫下避光反應20 min, 測定樣本光密度(OD)值, 并根據標準曲線計算樣品中檢測因子的含量。

1.2.5 Real-time聚合酶鏈式反應(PCR)法檢測中腦黑質中RORγt和IL-17的mRNA表達水平 行為學實驗后每組取6只小鼠常規處理取中腦黑質組織, Trizol提取總RNA, 逆轉錄合成cDNA, Primer 5設計引物, PCR反應條件設置為：95℃預變性30 s, 95℃變性5 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸20 s,40個循環。記錄內參基因與目的基因的Ct值, 運用2-△△Ct法進行數據分析。

1.2.6 Western blot法檢測中腦黑質中RORγt和IL-17的蛋白表達水平 行為學實驗后的小鼠每組取6只常規處理取中腦黑質組織制備樣本, 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、電轉。電轉過后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用TBS/T洗膜液清洗,封閉2 h后加入一抗溶液, 4℃包被過夜。洗滌后加入對應的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液, 室溫孵育1 h。再次洗滌后的PVDF膜用增強型化學發光劑溶液浸潤, 于全自動化學發光儀曝光。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 5軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示, 采用獨立樣本t檢驗和單因素方差檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學檢測及免疫熒光染色 PD模型表現出肢體震顫、尾部僵直、運動減少等異常行為學反應, PD模型組轉棒時間為(17.6±2.3)s顯著短于對照組的(112.1±8.6)s, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。PD模型組中腦TH陽性反應的神經元數目較對照組明顯減少。見圖2。

圖1 轉棒行為學實驗兩組小鼠轉棒時間

圖2 兩組小鼠中腦TH陽性反應神經元免疫熒光染色圖

2.2 IL-17和RORγt的表達水平 PD模型組外周血IL-17表達為(32.58±6.21)高于對照組的(7.46±2.10), 差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。PD模型組中腦黑質中RORγt和IL-17的mRNA表達水平分別為(8.87±1.12)、(5.66±0.85)高于對照組的(2.64±0.52)、(2.08±0.41), 差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 4, 圖 5。

圖3 兩組小鼠外周血IL-17表達水平

圖4 兩組小鼠中腦黑質中IL-17和RORγt的mRNA表達水平

圖5 兩組小鼠中腦黑質中IL-17和RORγt的蛋白表達水平的免疫印跡圖

3 討論

免疫炎癥是PD的重要病理機制［3］, 抗炎藥物降低罹患PD的風險提示了進一步研究炎癥機制及尋找可能的治療靶點具有重要意義［6］。本實驗中觀察到PD模型出現軀體僵直、震顫、豎毛、運動減少等行為異常表現。轉棒儀檢測顯示PD模型組轉棒時間顯著短于對照組, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。中腦組織TH特異性染色顯示PD模型組中腦DA能神經元顯著少于對照組。這些表明MPTP可誘導PD樣病理損害［7］。

淋巴細胞可穿過血腦屏障進入中樞神經系統［8］, 在PD病程中, CD4++T細胞在神經毒性損傷機制中發揮著重要作用［9］。Th17細胞是新近發現的CD4++T細胞, 有研究表明Th17是介導MPTP模型小鼠DA能神經元損傷的主要效應細胞［5］。本研究顯示PD模型外周血中IL-17顯著高表達, 證明系統性免疫炎癥反應可能參與其致病機制。PD模型的中腦黑質中RORγt和IL-17在基因和蛋白水平一致性表達上調, 表明Th17細胞及其炎癥因子可能參與了PD的中樞神經系統病理損傷過程。結合既往研究結果, 推測Th17引起的系統性免疫炎癥反應和中樞神經系統免疫炎癥反應可能協同促進了PD的病理損害。

綜上所述, Th17細胞及其炎癥因子可能通過誘發外周和中樞神經系統免疫炎癥反應參與PD的發生及發展, 進一步深入研究其具體作用和效應機制, 為探索PD免疫治療新方法奠定基礎。