貯藏期雞蛋新鮮度指標與S-卵白蛋白含量的相關關系

付丹丹，王巧華,2,*，馬美湖，許 鋒

（1.華中農業大學工學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學 國家蛋品加工技術研發分中心，湖北 武漢 430070；

3.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

雞蛋是人們日常生活中攝取蛋白質的重要來源之一，雞蛋在貯藏過程中的品質變化是一個復雜的過程，包括蛋質量損失率的增加[1]、pH值的變化[2]等。卵白蛋白占蛋清總蛋白的54%～63%，是蛋清蛋白的主要組成成分[3]，貯存期間蛋清中S-卵白蛋白相對質量分數由新產蛋的5%上升至冷藏6 個月后的81%[4]；因此蛋清蛋白的變化與雞蛋品質的關系是揭示雞蛋品質變化規律的最本質因素。通過對蛋清S-卵白蛋白含量變化的研究可以了解雞蛋品質變化的規律，其品質變化也可以通過S-卵白蛋白含量的改變得到很好的反映；同時，雞蛋中S-卵白蛋白的形成不依賴于雞齡、營養狀況和蛋質量等因素，且顯示出高的重復性與低的自然變異性，是評價雞蛋品質的潛在方法[5]。因此有關雞蛋貯藏期蛋白變化與品質關系的研究是蛋品加工基礎研究和保鮮研究領域的一個重要方向。目前關于S-卵白蛋白含量的研究主要集中在其形成機理、凝膠特性等理化性質方面[6-9]，也有少量對雞蛋pH值、溫度、貯藏條件對S-卵白蛋白形成影響的研究[10-11]，但在雞蛋品質對S-卵白蛋白含量形成影響方面的研究還不多見[12]；此外，有學者的研究表明高光譜、近紅外光譜等無損檢測的光譜信息與蛋清的哈夫值、酸堿度、黏度、蛋白質含量等有一定的相關性[13-15]。

本實驗將貯藏期間的雞蛋品質變化與S-卵白蛋白含量變化視為一個動態變化的系統，系統性地分析了雞蛋品質與S-卵白蛋白含量的相關關系，并研究了各雞蛋品質參數對S-卵白蛋白含量變化的影響程度，以期在不打破雞蛋的情況下就可以從生化本質的角度揭示蛋品品質變化機制，建立無損快速的雞蛋品質檢測方法，實現蛋品品質的有效無損監控。并以S-卵白蛋白含量為自變量建立了等價蛋齡模型，為雞蛋產業的貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當日產的新鮮海蘭褐殼雞蛋共108 枚，購于湖北武漢九峰養雞場。

NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4、NaCl、CH3COONa、CH3COOH、CuSO4·5H2O、C4O6H2KNa·4H2O等試劑均購于武漢百惠生物有限公司。

磷酸鹽緩沖液：將6.85 g NaH2PO4·2H2O與21.55 g Na2HPO4溶解于500 mL去離子水中，備用。每次實驗時取50 mL稀釋20 倍，調節pH值至7.5。

沉淀劑：0.5 mol/L NaCl溶液和0.1 mol/L CH3COONa溶液以體積比1∶1混合，用CH3COOH溶液調節pH值至4.7。

雙縮脲溶液：將3.6 g CuSO4·5H2O與7.2 g C4O6H2KNa·4H2O溶解于1 L的去離子水中，將72 g NaOH溶解于720 mL的去離子水中，在每次實驗時以兩者體積比為1∶1混合備用。

1.2 儀器與設備

SPX智能型生化培養箱 寧波江南儀器廠；SF2000電子數顯卡尺 桂林廣陸數字測控股份有限公司；JA2002電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；MP511 pH計 上海三信儀表廠；HH-8集熱式數顯水浴鍋國華電氣有限公；D U 7 0 0紫外-可見分光光度計美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

將所有雞蛋放置于（22±1）℃、相對濕度65%的恒溫恒濕培養箱中貯藏。每隔5 d隨機取樣，即貯藏第1、6、11、16、21、26、31、36、41天時，每次隨機挑選出12 枚雞蛋，依次編號，分別測定每枚雞蛋的品質參數及卵白蛋白的含量。

1.3.2 雞蛋品質參數的測定

1.3.2.1 哈夫值的測定

用電子天平分別稱取每枚雞蛋的質量（m/g），然后將其打破，手動測定雞蛋哈夫值，用數顯游標卡尺測定每枚雞蛋濃蛋白的高度，每枚雞蛋測3 次，并取其平均值作為每枚雞蛋濃蛋白高度值（H/mm）。按照公式（1）計算雞蛋的哈夫值[16]。

1.3.2.2 蛋黃指數的測定

利用數顯游標卡尺測定每枚雞蛋的蛋黃高度和蛋黃直徑，每個雞蛋測3 次，取其平均值作為雞蛋最終的蛋黃高度（h/mm）和蛋黃直徑（d/mm）。按照公式（2）計算雞蛋的蛋黃指數[17]。

1.3.2.3 蛋清pH值的測定

利用分蛋器將蛋清蛋黃分離，校準pH計，測定每個雞蛋蛋清的pH值，每個雞蛋測3次，取其平均值作為雞蛋最終的pH值。

1.3.2.4 卵白蛋白含量的測定

將用蛋清分離器分離出來的每枚雞蛋的蛋清分別置于1～12號100 mL小燒杯中，并分別在4 ℃條件下用磁力攪拌器攪拌均勻；用分析天平分別量取（5.00±0.05）g的蛋清至13～24號100 mL小燒杯中；并用70 mL量筒分別量取25 mL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液加入到每個小燒杯中，磁力攪拌5 min；用1 mL移液槍分別移取5 mL的混合溶液于2 支20 mL的玻璃密閉試管中（分別標記為iA、iB，i為雞蛋編號）；將iA號試管同時放置于75 ℃的水浴鍋中水浴加熱30 min后冷卻；向iA、iB試管中分別加入5 mL沉淀劑，混合傾倒于離心管中，并再分別向每個試管中加入5 mL沉淀劑沖洗試管內壁，盡量將試管中的液體轉入相應的離心管中。混勻離心管中的溶液，靜置10 min后，12 000 r/min離心5 min，分別從每個離心管上部用移液槍移取2 mL上清液至10 mL離心管中，向每個10 mL離心管中分別加入4 mL雙縮脲溶液，室溫下靜置30 min；用紫外-可見分光光度計測定每個樣品在540 nm波長處的吸光度（A），對照樣為2 mL去離子水與4 mL雙縮脲溶液混合液。按照式（3）計算S-卵白蛋白含量[18]。

1.3.2.5 灰色關聯度分析

灰色關聯分析是對一個系統發展變化態勢的定量分析的方法，是一種多因素統計分析法，它通過確定參考數列和多個比較數列的幾何形狀相似程度來判斷其聯系的緊密性，能夠反映曲線間的關聯程度，這與Pearson相關性分析有所不同，Pearson相關性分析僅是對變量之間的線性相關程度進行分析[19-21]，且相關性不等于因果性。灰色關聯分析的基本步驟如下：1）建立反應系統行為特征的參考數列x0（式（4））；2）建立影響系統行為的比較數列xi（式（5））；3）求初值化變換矩陣xi′（式（6））；4）求差序列Δi（k）（式（7））；5）計算關聯系數ξi（k）（式（8））；6）計算關聯度ζi（式（9））并排序。

式（8）中：Φ為分辨系數，其作用在于提高關聯系數間的差異顯著性，Φ∈（0，1），一般取Φ＝0.5。關聯系數是參考數列和比較數列在各時期的關聯程度值。

關聯度是參考數列和比較數列在整個時段中的平均關聯程度值。關聯度越大，說明該比較數列對參考數列的影響越大，反之，則影響越小[22]。在計算完關聯度后對所有獲得的關聯度進行排序，通過比較關聯度，就可以獲得多個因素對參考數列的影響程度，從而找出影響參考變量的主次因素[23]。

1.4 數據處理

通過MATLAB 2014a軟件對實驗獲得的數據進行灰色關聯度分析。利用SPSS 12.0軟件中的Pearson相關性檢驗進行相關關系研究，并利用One-way ANOVA中的LSD比較法進行顯著性分析。

2 結果與分析

業內沒有根據S-卵白蛋白含量對雞蛋分類的標準，國際上建立了通用的雞蛋哈夫值的分類標準，因此根據實驗獲得的數據，以S-卵白蛋白含量為因變量（x）、哈夫值為自變量（y）建立兩者之間的指數回歸關系（式（10））。

y=4.367 8×e-0.0294x（R=0.912 9） （10）

依據雞蛋哈夫值分類的標準[24]，將x＝72、60分別帶入上式中，得y＝53%、75%，因此將S-卵白蛋白含量分為3 類：y＜53%、53%＜y＜75%、y＞75%。各雞蛋品質參數與S-卵白蛋白含量之間的相關關系見表1。

表 1 S-卵白蛋白含量與各雞蛋品質參數的相關系數Table 1 Correlation coef ficients between S-ovalbumin content and egg quality parameters

2.1 雞蛋新鮮度品質指標與S-卵白蛋白含量的相關性

2.1.1 哈夫值與S-卵白蛋白含量的相關性

雞蛋新鮮度對貯藏期間蛋清S-卵白蛋白含量的影響見圖1。不同S-卵白蛋白含量的雞蛋之間的新鮮度差異極顯著（P＜0.01），并且隨著S-卵白蛋白含量的增加，雞蛋哈夫值逐漸減小。雞蛋哈夫值大小與蛋清S-卵白蛋白含量存在極顯著的負相關關系（R＝-0.913，P＜0.01）。由哈夫值的定義，其值由蛋質量和濃蛋白高度決定，由表1可以看出，蛋質量與S-卵白蛋白含量盡管也存在負相關性（R＝-0.367，P＜0.01），但是其線性相關程度比濃蛋白高度與S-卵白蛋白含量的線性相關程度（R＝-0.905，P＜0.01）要低得多，這與Masaaki[5]報道的S-卵白蛋白的形成不依賴于蛋質量相一致。因此雞蛋哈夫值對S-卵白蛋白含量的影響主要源于濃蛋白高度對S-卵白蛋白含量的影響，其原因可能是卵白蛋白中的巰基對濃蛋白高度的變化起到作用[7]。

圖 1 不同S-卵白蛋白含量下的哈夫值Fig. 1 Haugh unit at different S-ovalbumin contents

2.1.2 蛋黃指數與S-卵白蛋白含量的相關性

圖 2 不同S-卵白蛋白含量下的蛋黃指數Fig. 2 Egg yolk index at different S-ovalbumin contents

由表1可知，蛋黃指數與S-卵白蛋白含量呈極顯著負相關關系（R＝-0.900，P＜0.01），即蛋黃指數與S-卵白蛋白含量的線性相關程度高，S-卵白蛋白含量越高，蛋黃指數越小。由圖2可知，不同S-卵白蛋白含量雞蛋的蛋黃指數存在極顯著差異（P＜0.01），且隨著S-卵白蛋白含量的增加，蛋黃指數呈下降趨勢。此外，蛋黃指數與哈夫值存在極顯著的正相關關系（R＝0.901，P＜0.01），與pH值存在極顯著的負相關關系（R＝-0.636，P＜0.01）。

2.1.3 蛋清pH值與S-卵白蛋白含量的相關性

溫度和pH值是蛋清N-卵白蛋白轉化為S-卵白蛋白的主要因素[25]，由表1可知，蛋清pH值與S-卵白蛋白含量呈極顯著正相關關系（R＝0.648，P＜0.01），其相關程度沒有哈夫值與蛋黃指數的相關性高。由圖3可知，不同S-卵白蛋白含量下的蛋清pH值差異極顯著（P＜0.01），且隨著S-卵白蛋白含量的增加，pH值先增大后減小。此外，pH值與哈夫值呈極顯著負相關關系（R＝-0.700，P＜0.01）；pH值與蛋質量無顯著相關關系（R＝0.053，P＞0.05）；pH值與蛋黃指數呈極顯著負相關關系（R＝-0.636，P＜0.01），與蛋黃直徑呈極顯著正相關關系（R＝0.612，P＜0.01），與蛋黃高度呈極顯著負相關關系（R＝-0.553，P＜0.01）。

圖 3 不同S-卵白蛋白含量下的pH值Fig. 3 pH at different S-ovalbumin contents

2.2 雞蛋新鮮度指標與S-卵白蛋白含量的灰色關聯度分析

運用灰色關聯度分析法，將貯藏期間雞蛋品質變化與S-卵白蛋白含量的變化視為一個動態變化的系統，通過計算和分析雞蛋哈夫值、蛋黃指數、pH值等多因素與S-卵白蛋白含量之間的灰色關聯度及其大小次序，確定出影響S-卵白蛋白含量的主要因素，繼而得出雞蛋品質多因素與S-卵白蛋白含量之間關系的定量化分析結果。由于各雞蛋品質因素的量綱不同，不同量綱的因素之間難以比較；因此在進行灰色關聯度分析之前，采用均一化的方法對各品質指標進行無量綱處理[26]，其計算公式如式（11）所示。

式中：Mij’為第i行第j列的一個數值的無量綱值；Mij為第i行第j列的一個數值；Mj為第j列的平均值。

圖 4 貯藏期間無量綱化后的雞蛋新鮮度指標及S-卵白蛋白含量的變化規律Fig. 4 Variation in non-dimensionalized egg freshness indexes and S-ovalbumin content

由圖4可知，S-卵白蛋白含量隨著貯藏時間的延長逐漸增加，哈夫值和蛋黃指數隨著貯藏時間的延長逐漸減小，pH值隨著貯藏時間的延長先增加后減小。

選取S-卵白蛋白含量作為參考序列，各雞蛋品質指標作為比較數列。依據灰色關聯度的計算步驟，計算雞蛋品質因素與S-卵白蛋白含量的綜合灰色關聯度見表2。不同貯藏時間的雞蛋新鮮度指標與S-卵白蛋白含量的相對灰色關聯度變化趨勢如圖5所示。

表 2 雞新鮮度指標與S-卵白蛋白含量的綜合灰色關聯度Table 2 Comprehensive gray correlation degree between egg freshness indexes and S-ovalbumin content

圖 5 貯藏期間雞蛋新鮮度指標與S-卵白蛋白含量的灰色關聯度變化趨勢Fig. 5 Variation in gray correlation degree between egg freshness indexes and S-ovalbumin content during storage

由表2可知，貯期各新鮮度指標值對S-卵白蛋白含量的綜合灰色關聯度排序為：pH值＞蛋黃指數＞哈夫值。一般情況下，灰色關聯度在0.8以上，則認為參考數列與比較數列曲線間的關聯程度高，灰色關聯度在0.3～0.8之間，則可認為曲線間有弱的關聯性，灰色關聯度小于0.3，則認為曲線間沒有關聯性。

由圖5可知，貯藏期間雞蛋新鮮度指標與S-卵白蛋白含量的灰色關聯度在不斷變化，在貯藏第21天時，哈夫值和蛋黃指數與S-卵白蛋白含量的關聯度達到最高，約為0.9；pH值在貯藏第26天時與S-卵白蛋白含量的灰色關聯度達到最高，大于0.9。關聯程度越高，曲線同步變化程度越高。

綜上，每個品質因素與S-卵白蛋白含量的綜合灰色關聯度均大于0.6（表2），說明每個品質因素都對S-卵白蛋白含量有影響，其中pH值的影響最大，與S-卵白蛋白含量的同步變化程度最高，在各雞蛋品質影響因素中，是影響S-卵白蛋白含量變化的主導因素，本研究結論與Omana等[27]研究得出的S-卵白蛋白的增加可能是由于蛋清pH值增加的結論相吻合。

2.3 等價蛋齡預測模型

雞蛋不僅含有大量的優質蛋白，而且價格低廉，是消費者日常生活中的必備品，其新鮮度對消費者的食品安全有著重要的影響，有關貯藏期間雞蛋品質的評價和預測及其與貯藏時間的關系也一直是食品加工和保鮮領域的研究熱點，而蛋齡（即雞蛋貯藏的時間）并不能準確反映不同貯藏條件下雞蛋的真實鮮度[29-30]；因此，有學者提出利用等價蛋齡來估算不同貯藏條件下的雞蛋新鮮度[28]。對在22 ℃條件下貯藏的雞蛋蛋清中的S-卵白蛋白含量與貯藏時間之間進行Pearson相關性分析，結果表明S-卵白蛋白含量與貯藏時間呈極顯著相關（R＝0.992，P＜0.01）。本研究選取22 ℃、相對濕度65%的貯藏條件下獲取的S-卵白蛋白含量建立等價蛋齡的預測模型，用于評價貨架期不同貯藏條件下商業雞蛋的新鮮度。

圖 6 雞蛋等價蛋齡預測模型Fig. 6 Prediction model of equivalent egg age

以S-卵白蛋白含量為自變量，通過二次多項式回歸模型建立雞蛋等價蛋齡預測模型，如圖6所示，預測方程為：y＝0.001 03 x2+0.409x－8.260 3；其中y為雞蛋等價蛋齡，x為S-卵白蛋白含量。預測值與實測值的決定系數R2＝0.986 81，P＜0.01。由此可見，建立的等價蛋齡模型可靠性高，預測性比黃群等[10]等建立的指數回歸預測模型準確性更高。

3 結 論

雞蛋哈夫值與S-卵白蛋白含量之間存在極顯著負相關關系（R＝-0.913，P＜0.01），蛋黃指數與S-卵白蛋白含量之間存在極顯著負相關關系（R＝-0.900，P＜0.01），pH值與S-卵白蛋白含量間存在極顯著正相關關系（R＝0.648，P＜0.01）。

蛋質量與S-卵白蛋白含量盡管也存在極顯著負相關性（R＝-0.367，P＜0.01），但是其線性相關程度比濃蛋白高度與S-卵白蛋白含量的線性相關程度（R＝-0.905，P＜0.01）要低得多。

各品質因素與S-卵白蛋白含量的灰色關聯度均大于0.6，哈夫值、蛋黃指數及pH值對S-卵白蛋白含量的綜合關聯度排序為：pH值（灰色關聯度為0.742）＞蛋黃指數（灰色關聯度為0.663）＞哈夫值（灰色關聯度為0.646），pH值是影響S-卵白蛋白含量變化的主導因素。

在22 ℃貯藏條件下，S-卵白蛋白含量與貯藏時間呈極顯著正相關（R＝0.992，P＜0.01）。以S-卵白蛋白含量為自變量，通過二次多項式回歸模型建立雞蛋等價蛋齡預測模型，其決定系數R2＝0.986 81，P＜0.01，可靠性高。