五味子乙素對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的改善作用

劉 聰，孫偉靜，李 寧，高佳琪，于澤鵬，敬 舒，王春梅，孫靖輝，陳建光，李 賀,*

（1.北華大學藥學院藥理教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學附屬醫院，吉林 吉林 132013）

隨著全球人口不斷老齡化，衰老人群日益增多。學習記憶能力減退與障礙是衰老人群的主要特征。研發具有輔助改善記憶功能的保健食品及藥物前景廣闊。本研究前期工作顯示，五味子總木脂素對D-半乳糖所致衰老小鼠具有顯著的改善記憶作用[1-2]。但該作用主要由哪些活性成分引起尚不清楚。五味子乙素（schisandrin B，SCB）是五味子木脂素中含量最高的聯苯環辛烯類單體化合物，是五味子中主要活性成分之一[3-4]。已有研究報道SCB具有較強的抗氧化性[5-8]，但目前鮮有SCB對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力影響的相關研究。因此，本研究通過D-半乳糖建立小鼠衰老模型，探討SCB的改善記憶作用及相關機制，為開發輔助改善記憶功能的保健食品及藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級健康ICR小白鼠，雄性，體質量（20±2）g，由吉林大學實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（吉）：2015-0005。小鼠采取分籠飼養，且維持12 h∶12 h晝夜循環，飼料供給充足，自由飲水。

SCB 四川省維克奇生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純） 山東濰坊力特復合材料有限公司；二氧化鈦（分析純）、吐溫20（分析純） 天津永大試劑公司；D-半乳糖 美國S i g m a公司；HCl-Tris、30%丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、Tris、甘氨酸 北京鼎國試劑公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、MDA試劑 南京建成生物工程研究所；脫脂奶粉 美國BD公司；p53蛋白、p21蛋白、p19蛋白 英國Abcam公司；ECL顯色液碧云天生物制品有限公司；RNA抽提試劑盒 美國Vazyme公司；SYBR Green Real-time 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Super Mix 美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設備

infiniteM200全自動酶標儀 瑞士TECAN公司；Western blot電泳儀、電轉儀及實時熒光定量（quantitative real-time PCR，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；ChampChemi Professional+全自動多色熒光及化學發光凝膠成像系統 北京賽智創業科技有限公司；DT-200小鼠避暗儀、MT-200 Morris水迷宮分析儀 成都泰盟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥

ICR小鼠隨機分為4 組，每組15 只。1）正常對照組（CON）組：每天灌胃蒸餾水及頸后皮下注射生理鹽水；2）衰老模型（MOD）組：每天灌胃蒸餾水及頸后皮下注射220 mg/kg D-半乳糖；3）SCB（M）組：每天灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射220 mg/kg D-半乳糖；4）SCB（C）組：每天灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射生理鹽水。

1.3.2 小鼠避暗實驗

將小鼠放入避暗儀中，面部背向洞口放入明室，從小鼠進入洞口至其到達暗室的時間即為潛伏期。本實驗對小鼠訓練5 min，記錄在5 min內小鼠的錯誤次數。間隔24 h后進行第二次實驗。記錄每只鼠的潛伏期以及在5 min內出現的錯誤次數[9]。

1.3.3 Morris水迷宮實驗

將小鼠放在Morris水迷宮視頻跟蹤測試系統中，設置小鼠的訓練時間設定為120 s，在120 s內未達到終點的小鼠按120 s記錄。每隔24 h訓練1 次，采集第5天的實驗數據。第一次實驗之前將小鼠放在平臺附近，使其自動爬上3 次。以后每次訓練前將小鼠放在平臺附近，使其自主爬上到平臺一次。第6天把平臺去掉統計小鼠空間搜索能力。并記錄小鼠穿越平臺的次數和穿越有效區的次數[10]。

1.3.4 SCB對衰老小鼠體內SOD活力和MDA含量的影響

從1.3.3節的各組中隨機選取10 只小鼠，在末次給藥后30 min后處死小鼠，取出腦組織及血清，應用WST-1法檢測SOD活力，應用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。具體方法參照試劑盒說明書。

1.3.5 小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達的檢測

1.3.4節中小鼠末次給藥后30 min，每組取3 只小鼠腦組織，應用試劑盒提取細胞總RNA，按逆轉錄反應試劑盒說明操作合成cDNA。按試劑盒說明進行qPCR擴增，在GenBank里查找各基因序列號，采用Primer 6.0軟件進行引物設計，由北京鼎國昌盛生物工程公司合成，以β-actin為內參基因，引物序列見表1。

表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

qPCR條件為95 ℃、10 min，1 個循環；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個循環。95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃、15 s，1 個循環，制備溶解曲線。采用2-△△Ct進行相對定量。

1.3.6 Western blot法檢測腦組織中p19、p21及p53蛋白的表達情況1.3.4節中小鼠末次給藥后30 min，每組取3 只小鼠腦組織，加入裂解液，冰上裂解1 h，高速離心機離心取上清液。以二喹啉甲酸法測定組織蛋白濃度，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳分離p19、p53、p21蛋白。2 h電轉移至聚丙二氟乙烯膜，取出膜在Tris緩沖液（TBS-T）中漂洗5 min，然后用封閉液封閉1 h（含5%脫脂奶粉的TBS-T）。室溫孵育后棄去封閉液，分別加入一抗p19（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p21（1∶1 000），4 ℃溫育過夜后，TBS-T洗5 次，每次5 min。加入二抗（1∶2 000）溫育2 h，TBS-T洗5 次，每次5 min，最后加入顯色液ECL顯色。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。避暗實驗中的潛伏期、錯誤次數、Morris水迷宮實驗中的穿越平臺、穿越有效區次數、在目標象限停留時間及穿越平臺次數，小鼠腦組織中的SOD活力、MDA含量，qPCR和Western blot的實驗數據用±s表示，組間兩樣本均數比較采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 避暗實驗觀察SCB對小鼠學習記憶能力的影響

避暗實驗結果顯示，第2天的記憶測試中（圖1A），與CON組相比，MOD組小鼠潛伏期明顯縮短（P＜0.01），SCB（C）組小鼠未見明顯差異；與MOD組比較，SCB（M）組小鼠潛伏期明顯延長（P＜0.05）。如圖1B所示，與CON組相比，MOD組小鼠5 min內錯誤次數明顯增多（P＜0.01），SCB（C）組小鼠未見明顯差異；與MOD組比較，SCB（M）組錯誤次數減少（P＜0.05）。以上結果提示SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學習記憶能力。

圖 1 避暗實驗觀察SCB對腦衰老小鼠潛伏期和錯誤次數的影響（n＝ 15）Fig. 1 Effect of SCB on learning and memory in aging mice in dark avoidance test (n = 15)

2.2 Morris水迷宮實驗觀察SCB對衰老小鼠學習記憶能力的影響

2.2.1 定位航行實驗結果

圖 2 定位航行實驗中小鼠游泳潛伏期（n＝15）Fig. 2 Swimming latency of mice in orientation navigation test (n = 15)

定位航行實驗結果如圖2顯示，隨訓練時間延長，各組小鼠找到平臺時間逐漸縮短。與CON組比較，MOD組小鼠在訓練第4天（P＜0.05）及第5天（P＜0.01）找到平臺時間明顯延長；SCB（C）組未見明顯差異。與MOD組比較，在訓練第5天，SCB（M）組小鼠找到平臺潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。以上結果進一步提示SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學習記憶能力。

2.2.2 空間搜索實驗結果

如圖3、4所示，與CON組比較，MOD組小鼠在平臺所在象限的停留時間明顯縮短（P＜0.01），穿過原平臺的次數減少（P＜0.05），SCB（C）組未見明顯差異。與MOD組相比，SCB（M）組在平臺所在象限的停留時間明顯延長（P＜0.05）。以上結果進一步證實SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學習記憶能力。

圖 3 空間搜索實驗中SCB對腦衰老小鼠目標象限停留時間及經過平臺次數的影響（n ＝15）Fig. 3 Effect of SCB on the time spent in target quadrant and the number of platform crossing in aging mice in spatial probe test (n = 15)

圖 4 空間搜索實驗中小鼠游泳軌跡圖（n＝15）Fig. 4 Swimming trajectory of mice in spatial probe test (n = 15)

2.3 SCB對腦衰老小鼠腦組織SOD活力、MDA含量的影響

圖 5 SCB對腦衰老小鼠腦組織中SOD活力（A）及MDA含量（B）的影響（n＝15）Fig. 5 Effect of SCB on SOD activity (A) and MDA content (B) in the brain tissue of aging mice (n = 15)

如圖5A所示，與CON組比較，MOD組小鼠腦組織SOD活力明顯降低（P＜0.01），SCB（C）組小鼠腦組織SOD活力明顯增高（P＜0.05）；與MOD組比較，SCB（M）組小鼠腦組織SOD活力明顯增高（P＜0.05）。對各組小鼠腦組織M D A含量檢測結果如圖5 B所示，與CON比較，MOD組小鼠腦組織MDA含量明顯升高（P＜0.01），SCB（C）組小鼠腦組織MDA含量明顯降低（P＜0.05）；與MOD組比較，SCB（M）組小鼠腦組織MDA含量明顯降低（P＜0.05）。上述結果提示SCB可能通過提高小鼠腦組織的抗氧化能力而發揮抗腦衰老作用。

2.4 SCB對腦衰老小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達的影響

圖 6 SCB對小鼠腦組織p19、p53、p21 mRNA表達的影響（n＝3）Fig. 6 Effect of SCB on mRNA expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissues of mice (n = 3)

本研究應用qPCR及Western blot方法分別從mRNA水平及蛋白水平觀察各組小鼠p19、p53、p21基因的表達情況。qPCR結果如圖6所示，與CON組比較，MOD組小鼠腦組織p19、p53、p21 mRNA表達量明顯增多（P＜0.05）；與MOD組相比，SCB（M）組p19、p53、p21 mRNA表達量明顯減少（P＜0.05）。SCB（C）與CON組相比未見統計學差異。上述結果提示SCB可能通過抑制p19、p53、p21 mRNA的表達而發揮改善記憶作用。

圖 7 SCB對小鼠腦組織p19、p53、p21蛋白表達的影響（n＝3）Fig. 7 Effect of SCB on protein expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissue of mice (n = 3)

Western blot結果如圖7所示，與CON組比較，MOD組小鼠腦組織p19、p53、p21蛋白表達水平均明顯增多（P＜0.01）；SCB（C）組小鼠p19（P＜0.05）、p21（P＜0.01）蛋白表達水平明顯減少，p53蛋白表達水平未見明顯差異；與MOD組相比，SCB（M）組p19、p53、p21蛋白表達水平明顯減少（P＜0.01）。進一步驗證SCB有可能通過抑制p19、p53、p21表達而發揮相關作用。

3 討 論

人口的老齡化使抗衰老研究成為熱點。自由基損傷學說是眾多科學家共識的衰老學說[11-14]。隨著年齡的增長，體內多種自由基逐漸在細胞組織中累積，最終導致衰老產生。皮下注射D-半乳糖是常用的構建衰老模型的方法，此法通過自由基過量產生而引起衰老，與衰老學說的自由基理論相符合[15-17]。本研究前期結果顯示，五味子總木脂素能夠明顯改善D-半乳糖致衰小鼠的學習記憶能力，但其主要的活性成分尚不清楚。SCB是五味子木脂素中的單體化合物成分，已有文獻報道SCB具有較強的抗氧化能力[5-8]。因此，猜測五味子總木脂素的上述作用可能與SCB密切相關。前期對SCB的最佳劑量進行了摸索，結果顯示20 mg/kg效果較好，因此，在本研究中將20 mg/kg SCB作為單一的給藥劑量給予D-半乳糖致衰小鼠。此外，本實驗設立了SCB（C）組，即將SCB應用于健康小鼠，以觀察SCB對健康小鼠的影響。

SOD是機體最主要的抗氧化酶，它在機體氧化與抗氧化平衡中起著重要的作用，而MDA作為脂質過氧化反應的重要產物，在腦組織中的含量隨著機體的逐漸衰老而不斷升高，是反映自由基導致的機體損傷程度的重要指標[18-21]。本實驗結果顯示，SCB可以提高衰老小鼠腦組織SOD的活性，降低MDA含量，顯示較強的抗氧化作用；另外，與空白組相比，SCB（C）組小鼠腦組織SOD活力明顯增高，MDA含量明顯降低，提示SCB在衰老模型鼠及健康鼠都表現出明顯的抗氧化作用，該結果與其他研究SCB抗氧化功能的報道[6-8]是一致的。

氧化應激引發細胞衰老的多種途徑涉及p53基因表達的改變。p53作為一種位于多種調控網絡關鍵節點的應激蛋白，受到刺激便會大量堆積，進而促進凋亡因子Puma和Bax等的表達，誘導細胞凋亡，進而導致機體衰老[22-24]。p53水平主要取決于泛蛋白化和隨后的蛋白酶降解速率。主要針對p53的E3-type泛蛋白連接酶是MDM2，可以促進p53被泛蛋白介導的蛋白酶體降解。p19ARF是p53的上游基因，p19ARF蛋白直接結合并抑制MDM2的活性，使其不能介導p53蛋白的降解，其表達水平升高是p53激活的原因之一[25-26]。p53的下游靶分子是p21，p21是Cyclin依賴的蛋白激酶的抑制因子，既可導致G1期停滯也可以導致G2期停滯，在細胞受到刺激后，p53表達水平迅速上調，激活p21基因，進而抑制Cyclin A/E-CDK2的活性，阻止細胞周期的進行[27-30]。可見，p19-p53-p21信號途徑在細胞衰老中發揮重要調節作用。本研究應用qPCR及Western blot方法分別從mRNA水平及蛋白水平觀察各組小鼠p19、p53、p21的表達情況。結果顯示兩種方法得到的結果是一致的，即SCB能夠在mRNA及蛋白水平上下調D-半乳糖致衰小鼠p19、p53、p21基因的表達進而發揮相關作用。

由于小鼠學習記憶能力容易受外界環境因素的影響，本實驗中選擇了兩種不同的行為學實驗方法（避暗實驗、Morris水迷宮實驗）進行對比印證，以減少實驗結果的不穩定性。實驗結果表明，無論在避暗實驗還是水迷宮實驗中，與MOD組比較，SCB均表現出良好的學習記憶能力；與CON組比較，SCB（C）組未見明顯差異。提示SCB能夠改善D-半乳糖所致的衰老小鼠的學習記憶能力，而對健康小鼠學習記憶能力的影響較小，這可能是由于健康鼠未出現D-半乳糖所致的學習記憶障礙，SCB的抗氧化作用而發揮的記憶改善作用不能充分體現。其具體機制將在后續的實驗中繼續研究。

綜上，本研究證實了SCB對D-半乳糖致腦衰老小鼠的學習記憶能力具有改善作用，該作用可能與其提高小鼠抗氧化能力以及降低小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達水平有關。本研究為開發具有輔助改善記憶功能的藥物及保健食品提供理論依據。