高效發(fā)酵人工窖泥的制備及應(yīng)用研究

薛正楷 ，趙金松 ，張宿義 ，倪 斌 ，5

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院白酒學(xué)院，四川瀘州 646001； 2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川瀘州646000；3.四川理工學(xué)院，四川自貢643000； 4.瀘州老窖股份有限責(zé)任公司，四川瀘州646002；5.瀘州江潭窖酒業(yè)有限公司，四川瀘州646005）

窖泥是濃香型白酒釀造的基礎(chǔ)，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到所產(chǎn)基酒的質(zhì)量。窖泥中微生物類群非常復(fù)雜，棲息著大量的己酸菌、乳酸菌、丁酸菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等窖泥功能菌，對產(chǎn)生濃香型白酒的風(fēng)格起著十分重要的作用[1]。窖泥質(zhì)量不僅在于其理化指標(biāo)豐富程度,更取決于這些有益窖泥功能菌的種類、數(shù)量及產(chǎn)物的代謝能力，以及營養(yǎng)成分的合理比例，是直接影響白酒質(zhì)量的關(guān)鍵所在[2]。正是由于這些有益功能菌的大量生長、繁殖、代謝以及相互協(xié)調(diào)作用，才賦予了白酒的獨特香型，造就了以已酸乙酯為主體香的濃香型白酒的典型風(fēng)格[3]。因此，窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。但是傳統(tǒng)人工窖泥在生產(chǎn)過程中有兩個突出問題：新窖泥自然老熟時間太長；使用一段時間后窖泥會老化而影響酒的品質(zhì)[4-5]。而在傳統(tǒng)人工窖泥培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過采取加入?yún)f(xié)調(diào)而全面的優(yōu)良菌種、科學(xué)合理的培養(yǎng)配方，增加窖泥中有益微生物菌群和各種營養(yǎng)成分，并加速其老熟，以縮短自然老熟時間[6-14]。

擬采用本研究選育的產(chǎn)己酸菌菌株L.fusiformis-ep-SigB，制備窖泥，為該菌株的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料

1.1 窖泥制備材料

窖皮泥、老窖泥、豆餅粉、麩皮由瀘州精圣酒莊惠贈；黃泥土、酒糟、黃水、底鍋水、酒尾由瀘州江潭窖酒業(yè)有限公司惠贈；中偏高溫大曲粉，購自瀘州懷玉制曲有限公司；酵母膏、碳酸氫鈉（NaHCO3）、氟化鈉（NaF）、硫酸鈉（Na2SO4）、乙酸鈉（CH3COONa）、EDTA二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）、酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）、氫氧化鈉(NaOH)、碘化鉀（KI）、氯化汞（HgCl2）、氫氧化鉀（KOH）、酒石酸鈉（Na2C4H4O6·2H2O）、鉬酸銨（[(NH4)6Mo2O7·4H2O]）、氯化亞錫（SnCl2）、四苯硼鈉[NaB(C6H5)4]、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、硫酸銨（[(NH4)2SO4]）、硝酸鉀（KNO3）、硫酸鉀（K2SO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、硫酸鎂（MgSO4）、無水乙醇、無磷活性炭、阿拉伯膠粉、甘油、甲醛，購自成都科龍試劑廠；FastDNA?SPINKitforSoil購自MPBIO公司；L.fusiformis-ep-SigB己酸菌液由本實驗室提供。

1.2 人工窖泥配方

根據(jù)文獻和生產(chǎn)實踐[15-19]，本項目配制下列8個窖泥方案進行篩選。

方案1（X1）：L.fusiformis-ep-SigB菌液2.5%；20%vol酒尾10%；黃泥土50%；窖底泥0.5%；優(yōu)質(zhì)大曲粉8%；香醅8%；磷酸氫二鉀0.05%；乙酸鈉1.5%；酵母膏0.54%；黃水8.45%；水10.46%。

方案2(X2)：黃黏土40%；泥碳5.04%；窖皮泥15%；L.fusiformis-ep-SigB菌液1.5%；大曲粉2.5%；豆餅粉1.5%；骨粉0.5%；母（底）糟或丟糟1%；黃漿水（按固體材料比）5%；尾酒（20%vol）15%；醋酸鈉3%；磷酸氫二鉀0.05%；水9.91%。

方案3(X3)：黃泥40%；糧糟3%；曲粉2%；L.fusiformis-ep-SigB菌液5%；黃水3%；豆餅粉1%；磷酸氫二鉀0.02%；尾酒10%；泥碳5%；污泥2%；底鍋水1%；窖皮泥4.57%；生香窖母4%；水19.41%。

方案4(X4)：黃黏土53%；母糟6.5%；黃水6.5%；中高溫曲粉2.5%；窖皮泥7.89%；豆餅粉1%；L.fusiformis-ep-SigB菌液6.5%；30%vol低度酒1.3%；骨粉0.7%；水14.11%。

方案5(X5)：黃泥100%；老窖泥5%；窖皮泥10%；酒糟8%；大曲粉3%；豆餅粉1.5%；黃水8%；酒尾5%；營養(yǎng)鹽0.11%；乙酸鈉0.1%；L.fusiformis-ep-SigB菌液10%；底鍋水適量。

方案6(X6)：黃泥100%；窖皮泥10%；酒糟5%；大曲粉2%；豆餅粉1.2%；麩皮3%；L.fusiformis-ep-SigB菌液10%；酒尾（12%vol）15%；黃水5%；乙酸鈉0.05%；磷酸氫二鉀0.01%；酵母膏0.01%；藕塘泥適量；底鍋水適量。

方案7(X7)：以黃泥為100%標(biāo)準(zhǔn)計,黃水10%,酒糟10%，L.fusiformis-ep-SigB菌液10%,曲粉1.0%，豆餅1.5%，NaAc 0.1%，KH2PO40.16%，(NH4)2SO40.005%，MgSO40.002%，蛋白胨0.01%，酒精4%。

方案8(X8)：以黃泥100%為標(biāo)準(zhǔn)計，老窖泥3%；L.fusiformis-ep-SigB菌液10%；酒糟8%；大曲粉2%；豆餅粉1.5%；營養(yǎng)鹽0.11%；乙酸鈉0.1%；酵母膏0.1%；硫酸銨0.05%；磷酸氫二鉀0.04%；硫酸鎂0.02%；黃水8%；酒尾5%；底鍋水適量。

1.3 微生物計數(shù)培養(yǎng)基

微生物計數(shù)培養(yǎng)基分別采用細菌培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）、放線菌培養(yǎng)基（高氏1號瓊脂培養(yǎng)基）、真菌培養(yǎng)基（馬丁（Martin）-孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基）、巴氏梭狀芽孢桿菌合成培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 窖泥培養(yǎng)

配制8種窖泥配方，將溫度控制在40℃，培養(yǎng)60 d，每種窖泥3個重復(fù)。

2.2 泥樣微生物分析采用稀釋平板計數(shù)法

用接種匙稱取8種方案的0.5 g新鮮窖泥于4.5mL無菌水中，置于30℃的搖床中振蕩30～40min。再從中用移液管吸取0.5 mL菌液到盛有4.5 mL無菌水的試管中，一直稀釋至10-5梯度。從適度的稀釋液中分別吸取0.1 mL菌液到已倒好的平板上（每種2個）（事先觀察平板是否被污染），然后用涂布器涂勻，將涂布好的培養(yǎng)皿倒置放于培養(yǎng)箱中。細菌在35℃下培養(yǎng)1～2 d。同時對細菌做厭氧培養(yǎng)，在真空干燥箱中抽真空至0.08 MPa，在35℃條件下培養(yǎng)3～4 d。真菌在30℃下培養(yǎng)2～3 d，芽孢桿菌30℃下培養(yǎng)1～2 d，在真空干燥箱中抽真空至0.08 MPa。放線菌于30℃下培養(yǎng)5～7 d。

2.3 理化分析方法

氨態(tài)氮的測定采用納氏試劑比色法，樣品需用新鮮窖泥，同時測定水分，以換算成絕干樣的含量；水分及揮發(fā)物測定采用恒重法，腐殖質(zhì)的測定采用重鉻酸鉀氧化法，有效磷的測定采用碳酸氫鈉法，pH值采用pH計測定，鈣的測定采用高錳酸鉀滴定法；白酒總酸、總酯及組成酸、酯的測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中總酸、總酯的測定方法。

2.4 感官評定、理化評定

采用趙長青等方法[20]，對8塊窖泥進行感官和理化評定，結(jié)果見表1和表2。

表1 窖泥感官質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)表(總分60分)

表2 窖泥理化、微生物指標(biāo)評定表(總分40分)

2.5 窖泥配方細菌多樣性分析

窖泥送上海美吉生物有限公司完成。具體方法如下：采用 FastDNA? SPINKitforSoil對8個的窖泥配方細菌DNA進行提取。以不同配方窖泥細菌總DNA為模板，引物采用細菌16S rRNA V4—V5 區(qū)引物515F（5′-148-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和907R 149 （5′-CCGTCAAATTCMTTTRAGTTT-3′）進行Touch Down PCR擴增,利用Illumina高通量測序儀對8個窖泥細菌DNA PCR擴增產(chǎn)物進行測序分析，為了確保實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及普遍性，需對獲得的原始序列進行適當(dāng)?shù)暮Y選，去掉低質(zhì)量的序列，進而獲得滿足后續(xù)分析要求的高質(zhì)量序列。通過與核糖體數(shù)據(jù)庫（ribosomal database project，RDP）已知序列的比對，修剪適配器和核糖體標(biāo)簽來減少測序錯誤率。利用微生物生態(tài)學(xué)的定量分析（quantitative in sights into microbial ecology，QIIME）平臺對窖泥細菌DNA序列進行高級生物信息分析，每個樣品剩余的高質(zhì)量序列用于劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。在97%相似度的OTUs進行同源性比對的基礎(chǔ)上，評估窖泥樣品細菌的豐富度（Chao指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)）。此外，主成分分析（principal component analysis，PCA）用來反映不同窖泥樣本之間細菌組成的差異。

圖1 夾泥發(fā)酵

2.6 生產(chǎn)試驗

按窖泥配方X8制備的窖泥，將窖泥放置于竹筒中，將竹筒放置于濃香型白酒窖池糟醅中層（圖1I），A、B糟層均放置裝滿窖泥的竹筒（竹筒表面密布小孔），每窖池放置竹筒180個，共90 kg窖泥；共進行3個重復(fù)試驗。按正常工藝發(fā)酵60 d，蒸酒，取酒進行氣相色譜分析。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用sigmaplot14進行繪圖；采用spss和excel進行數(shù)據(jù)處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 細菌有氧計數(shù)

采用菌落計數(shù)的方法，對有氧條件下不同發(fā)酵時間的平板進行細菌菌落計數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖2 有氧條件下的細菌數(shù)

分析圖2可知，8個方案除X6方案在第40天達到菌落最大值以外，其余方案均在第60天達到最大菌落數(shù)，每方案最大菌落數(shù)分別為：98.7（第60天）、67.6（第60天）、42（第60天）、78.7（第60天）、76.4（第 60 天）、61.2（第 40 天）、37.7（第 60 天）、127.5（第60天）（×105cfu/mL），可見，60 d發(fā)酵窖泥在有氧條件下，X8在60 d時，細菌數(shù)最大菌落數(shù)為127.5（×105cfu/mL），其次是方案1，在60 d時最大菌落數(shù)為98.7（×105cfu/mL）。

3.2 細菌無氧計數(shù)

采用菌落計數(shù)的方法，對無氧條件下不同發(fā)酵時間的平板進行細菌菌落計數(shù)，結(jié)果見圖3。

圖3 無氧條件下細菌菌落數(shù)

分析圖3可知，方案X1到方案X8最大菌落數(shù)分別為：151.7（第60天）、137.2（第60天）、32.1（第60天）、75.8（第40天）、77.2（第40天）、79.2（第60天）、89.8（第60天）、145.7（第60天）（×105cfu/mL），可見，發(fā)酵窖泥在無氧條件下，8個方案中最大菌落數(shù)為X1，其細菌數(shù)最大菌落數(shù)為157.1（×105cfu/mL）；其次是X8在60 d時最大菌落數(shù)為145.7（×105cfu/mL），將二者菌落數(shù)進行成對數(shù)據(jù)T檢驗，其Sig=0.624＞0.05，表明二者差異不顯著。

3.3 放線菌計數(shù)圖

采用菌落計數(shù)的方法，對無氧條件下不同發(fā)酵時間的平板進行放線菌菌落計數(shù)，結(jié)果見圖4。

圖4 無氧條件下放線菌菌落數(shù)

分析圖4可知，總體上看，放線菌菌落數(shù)，0～20 d時，逐漸降低，20～60 d時，菌落數(shù)逐漸增加，60 d時，方案X8菌落數(shù)最多，達到26（×105cfu/mL）,其次是方案X4，菌落數(shù)達16（×105cfu/mL）。

3.4 芽孢桿菌

采用平板菌落計數(shù)的方法，對無氧條件下不同發(fā)酵時間的平板進行芽孢桿菌菌落計數(shù)，結(jié)果見圖5。

圖5 無氧條件下芽孢桿菌菌落數(shù)

分析圖5可知，8個方案中芽孢桿菌最大值為方案X8，其芽孢桿菌在第60天達到53.4（×105cfu/mL），其次是方案4，為49.6（×105cfu/mL）。

3.5 真菌

采用平板菌落計數(shù)的方法，對無氧條件下不同發(fā)酵時間的平板進行真菌菌落計數(shù)，結(jié)果見圖6。

圖6 無氧條件下真菌菌落數(shù)

分析圖6可知，在60 d時，真菌菌落在方案X4達到最大值32.4（×105cfu/mL），其次為方案X8，真菌菌落達到17.3（×105cfu/mL）。

通過以上分析，可知X8方案中的放線菌、細菌（有氧和無氧）、芽孢桿菌比其他方案都多，真菌X4方案最多，X8方案其次，總體上看，X8方案為最優(yōu)方案。

3.6 理化性質(zhì)

對8個窖泥培養(yǎng)方案進行氨態(tài)氮、速效鉀、有效磷、pH值和含水量分析，結(jié)果見表3。

采用表1和文獻對窖泥理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，X8和X4較優(yōu)。

基于表2對8個窖泥方案進行分析，結(jié)果見表4。

表3 8個窖泥培養(yǎng)方案理化分析

表4 8個窖泥培養(yǎng)方案的感官評定結(jié)果

從表4可知，方案8感官評價較好。

3.7 窖泥群落結(jié)構(gòu)分析

利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對窖泥細菌DNAPCR產(chǎn)物進行測序分析，通過數(shù)據(jù)庫比對得到窖泥細菌的種類，并進一步計算各種細菌所占細菌總數(shù)的比例（即相對含量），結(jié)果見圖7。

圖7 不同窖齡窖泥與8個人工窖泥細菌群落結(jié)構(gòu)分析

從圖7可知，4年、10年、50年和100年窖底泥中細菌以厚壁菌門（Firmicutes）最多，占細菌總體群落結(jié)構(gòu)的90%以上。由于該門是原核生物界中一類細胞壁厚度為10～50 nm細菌的高級分類單元，包括一大類細菌，多數(shù)為革蘭氏陽性，有細胞壁結(jié)構(gòu)，少數(shù)缺乏細胞壁而不能被革蘭氏方法染色，如柔膜菌綱（Mollicutes）（如支原體），但也和其他革蘭氏陽性菌一樣缺乏第二層細胞膜。厚壁菌門細胞壁含肽聚糖量高，為50%～80%，細胞壁厚10～50 nm，革蘭氏染色呈陽性。厚壁菌門多為球狀或桿狀，也有不規(guī)則桿狀、絲狀或分枝絲狀等；很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境。很多環(huán)境中都可找到芽孢，很多著名的病原菌都能產(chǎn)生芽孢；厚壁菌門原本包括所有革蘭氏陽性菌，主要由芽孢桿菌綱(Bacilli)、梭菌綱(Clostridia)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、熱石桿菌綱(Thermolithobacteria)及一些不確定的遺傳類群組成，其中芽孢桿菌綱和梭菌綱構(gòu)成了厚壁菌門的主體；在8個人工窖泥中，厚壁菌門占細菌群落總量最大的為X4，相對比例達到近70%，其次為X8占55%左右。

在8個人工窖泥中，變形菌門（Proteobacteria）也是群落結(jié)構(gòu)中相對比例較高的一個門，為革蘭氏陰性菌，其外膜主要由脂多糖組成。很多變形菌門細菌利用鞭毛運動，但有一些非運動性的種類，或者依靠滑行來運動。此外還有一類獨特的黏細菌，可以聚集形成多細胞的子實體。變形菌門包含多種代謝種類。大多數(shù)細菌為兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活，但有很多例外。很多并非緊密相關(guān)的屬可以利用光合作用儲存能量，因其多數(shù)具有紫紅色的色素，被稱為紫細菌，其中X1中幾乎占了細菌群落結(jié)構(gòu)的50%，X4和X8中分別占了10%和15%。

3.8 生產(chǎn)實驗

取發(fā)酵60 d的蒸餾原酒，進行氣相色譜檢測，結(jié)果如表5。

對試驗組和對照組的主要乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、總酸、總酯采用配對數(shù)據(jù)T檢驗進行比較，結(jié)果表明：試驗組與對照組間乙酸乙酯（Sig=0.111＞0.05）、乳酸乙酯（0.05＞Sig=0.022＞0.01）差異不顯著，試驗組與對照組間己酸乙酯（Sig=0.001＜0.01）、丁酸乙酯（Sig=0.002＜0.01）、總酯（Sig=0.001＜0.01）、總酸（Sig=0.009＜0.01）差異極顯著。

表5 原酒中主要風(fēng)味物質(zhì)分析

4 結(jié)論

本項目通過對8個人工窖泥方案進行細菌、真菌、放線菌、芽孢桿菌平板計數(shù)分析、窖泥的理化分析、細菌群落結(jié)構(gòu)比較分析，結(jié)果表明，添加L.fusiformis-ep-SigB發(fā)酵液的X8號窖泥配方具有較好的各項指標(biāo)，為最優(yōu)窖泥配方。

采用添加L.fusiformis-ep-SigB發(fā)酵液的X8號方案進行窖泥制備，對發(fā)酵60 d的窖泥采用夾泥發(fā)酵工藝進行生產(chǎn)試驗，結(jié)果表明，試驗組與對照組間乙酸乙酯（Sig=0.111＞0.05）、乳酸乙酯（0.05＞Sig=0.022＞0.01）差異不顯著，試驗組與對照組間己酸乙酯（Sig=0.001＜0.01）、丁酸乙酯（Sig=0.002＜0.01）、總酯（Sig=0.001＜0.01）、總酸（Sig=0.009＜0.01）差異極顯著，本試驗成功篩選出可用于濃香型白酒的窖泥配方。