濃香型窖泥功能菌的培養工藝改進試驗

楊愛華 ，劉 雪 ，2，張學梅 ，曹建全 ，2

（1.山東景芝酒業股份有限公司，山東景芝262119； 2.山東省釀造食品生物發酵技術重點實驗室，山東景芝262119）

己酸菌是一類梭狀芽孢桿菌，其代謝產物己酸是濃香型白酒主體香氣物質己酸乙酯的前體物質，因此己酸菌在窖池內生長及產酸能力強弱將直接影響到白酒的品質。長期以來，如何提高以己酸菌為目的的有益窖泥功能微生物的數量，增強己酸菌代謝產生己酸的能力，一直是酒廠及科研單位探索和研究的方向。各酒廠分離得到的己酸菌產生能力不盡相同，一般為3～6 g/L[1]。如彭兵等[2]通過對從優質窖泥中分離獲得的己酸菌發酵條件的優化，己酸產量為4.36 g/L；薛正楷等[3]篩選得到的己酸菌產己酸能力達到了5.47 g/L；本廠從優質老窖泥中篩選得到1株實驗室產酸水平在6.5 g/L的己酸菌[4]。

影響己酸菌生長繁殖以及代謝產酸的因素較多，包括碳、氮、礦物質元素、水分、溫度、酸度、乙醇濃度等，且在白酒釀造過程中，己酸菌主要以窖泥為生長繁殖的載體。而窖泥中除含有己酸菌之外，還存在大量的丁酸菌、甲烷菌、放線菌等共棲微生物[5]。近年來，己酸菌混合培養體系引起了廣泛關注，利用微生物之間共棲性來推動己酸菌的發酵能力。陳翔等在己酸菌培養基中加入大曲粉、粉碎的酒醅，并將培養成熟的混合己酸菌液用于窖泥制作，取得了較好的效果；司波等[6]從己酸菌的生長特性出發，改善工藝條件，加入了窖泥、黃水和香醅，創造利于己酸菌生長和產酸且有效抑制雜菌生長的環境，提高了己酸菌培養液的質量及合格率；郭威等[7]篩選得到1株對己酸菌產酸有明顯促進作用的優良放線菌；此外，己酸菌與丁酸菌[8]以及己酸菌與酵母混合培養都取得了很好的效果。

本研究從菌種復壯、大曲及窖泥處理方式和己酸菌與酵母混合培養等方面出發，改進窖泥功能菌液的培養工藝，增強己酸菌生長及產酸能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

己酸菌JZ-79、JZ-80由本廠優質老窖泥中分離得到；酵母菌由本實驗室篩選并保藏；窖泥取自本廠優質老窖泥；大曲粉為本廠自制。

1.1.2 試劑

乙酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、碳酸鈣、硫化鈉、乙醚、乙醇、瓊脂粉、硫酸銅等，國藥集團化學試劑有限公司；酵母膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.3 培養基

磨口三角瓶、平底燒瓶及卡氏罐培養基：酵母膏5 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO40.2 g/L、K2HPO40.4 g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、NaAc 6 g/L,加蒸餾水定容至1 L，121℃下滅菌20 min；接種前加入無水乙醇2%、CaCO35 g/L。

1.2 儀器與設備

MLS-3751-PC高壓蒸汽滅菌鍋，日本松下公司；DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱、DNP型電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；氣相色譜儀，美國Agilent 7890A型氣相色譜儀；色譜柱，CP-WAX 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；厭氧發酵罐，山東泰山集團泰安市普瑞特機械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 己酸菌的復壯

對所用己酸菌種包括JZ-79、JZ-80以及取自本廠窖池的優質老窖泥，進行復壯：85℃水浴加熱10 min，按10%接種量接種于磨口三角瓶中，培養7 d后，測定各項發酵參數，包括細菌總數、硫酸銅顯色，總酸、己酸、乙酸及丁酸含量，共進行4個輪次。

1.3.2 己酸菌的發酵罐培養

(1)己酸菌種子液的培養：將復壯后的己酸菌以體積分數10%的接種量接種到磨口三角瓶內，接種后三角瓶內裝液量控制在90%以上，并對三角瓶封口。三角瓶內培養成熟的己酸菌按10%接種量接種于1 L的平底燒瓶內進行擴大培養，隨后接入卡氏罐中培養成熟，作為種子使用。

(2)大曲及窖泥實驗方法：研究不同窖泥及大曲處理方法對發酵結果的影響，不同接種量及窖泥、大曲處理方式見表1。

表1 大曲及窖泥處理方法設計

(3)己酸菌與酵母菌的混合培養

酵母菌種子液培養：從試管中接入經過培養基滅菌的小三角瓶，再以10%接種量接入大三角瓶，隨后以10%接種量轉入小型發酵罐中繼續擴大培養，培養成熟，作為種子液使用。

己酸菌與酵母的混合培養：在發酵罐培養基中接入10%的按(1)方法培養的己酸菌種子液和2%上述培養方法得到的酵母菌種子液，混合培養，培養溫度為35℃，時間為7 d。

1.3.3 菌體濃度測定

血球計數板計數：取5 mL適量培養液，以超純水稀釋適當倍數，用血球計數板計數富集菌液中的活菌數。

細菌總數計數：發酵結束后，采用上述血球計數板方法對發酵液中總菌數進行計數。

芽孢桿菌計數：發酵結束后的發酵液搖勻后取2 mL，加入8 mL無菌水中，80℃加熱10 min，冷卻后接入EAM培養基中，用封口膜封口，35℃培養24 h，再利用上述血球計數板法進行計數。

1.3.4 硫酸銅顯色法[9]

吸取2 mL的培養液加入到試管中，加入2 mL 2%的CuSO4和1 mL乙醚，振蕩搖勻后靜置分層，觀察乙醚層，呈現藍色則說明有己酸生成。

1.3.5 氣相色譜法測定發酵樣品中的有機酸含量

色譜檢測條件：CP-WAX 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；檢測器為氫火焰離子檢測器；柱溫采取程序升溫，初始溫度為35℃，保持3 min，然后以3.5℃/min的速率升溫，升至180℃，再以15℃/min升至200℃，保持10 min；進樣口溫度為220℃，檢測室溫度為240℃；載氣：(99.999%高純氮氣)流速為30 mL/min，氫氣為30 mL/min，空氣為350 mL/min；柱流速為0.8 mL/min，分流比35∶1,進樣量為0.8 μL。

2 結果與分析

2.1 己酸菌的復壯

長期保藏以及重復使用的己酸菌菌種，其繁殖及產酸能力會有所下降，利用熱處理的方法對其產酸能力進行復壯。菌株JZ-79、JZ-80由本廠分離篩選，利用甘油管法保藏于-80℃冰箱，窖泥為本廠優質老窖泥。對上述菌株采用80℃處理10 min，菌數變化如圖1。熱處理發酵7 d，JZ-79、JZ-80及窖泥1的菌數變化趨勢一致，活菌數有所下降，特別對窖泥而言，熱處理淘汰了大量的雜菌。連續熱處理復壯，菌數基本保持不變。

圖1 己酸菌復壯不同輪次菌數的變化趨勢

經過兩輪次復壯后，總菌數有所降低，但己酸產量明顯增加(圖2)。菌株JZ-79及優質老窖泥經復壯兩輪己酸產量最高，分別為2909.7 mg/L和3113.1 mg/L，JZ-80復壯一輪己酸產量最高為3260.2 mg/L。可能是由于分離得到的菌種不同，芽孢的耐熱能力各不相同，菌株達到最大產己酸能力需要經過復壯的輪次不同。

2.2 大曲不同處理方式對己酸菌發酵影響

由表2可知，將大曲粉進行加熱處理，己酸產量為2762.7 mg/L，比未處理的2324.8 mg/L高了18.8%。大曲粉內除含有可提供己酸菌生長的營養物質外，還有大量的其他微生物，未經熱處理的大曲粉，大曲內的微生物也將繁殖，導致大量雜菌的生長，而己酸菌的生長受到抑制，致使己酸產量受到影響。而熱處理的方法淘汰了大量的雜菌。因此，在己酸菌培養過程中，可添加適量大曲粉，且大曲粉需在罐內經熱處理，以提供己酸菌生長必需的營養物質，提高發酵過程中己酸菌濃度，再結合其他強化己酸合成的策略，從而提高己酸最終產量。

2.3 窖泥不同處理方式提高己酸產量

本輪實驗探討了己酸菌大罐培養基中添加的窖泥的處理方法對發酵的影響。結果如表3，發現以純卡氏罐己酸菌種子接種以及純窖泥接種時，己酸含量分別為2762.7 mg/L和2613.8 mg/L。當二者同時接種時，己酸含量為3029.5 mg/L，較單獨接種分別提高了9.7%和15.9%。純種培養的己酸菌，菌株強壯且產酸能力強，但己酸菌生長及產酸對培養條件要求較高。而窖池內環境非常復雜，在己酸菌培養過程中添加適量的窖泥，培養成熟窖泥中含有豐富的微生物及微量元素，對于促進己酸菌產酸及適應窖池內環境必不可少。同時發現，當窖泥經過加熱處理之后再接種，己酸產量略有降低，為2934.6 mg/L，較未經過處理時僅降低了3.1%。但經熱處理后，能夠淘汰窖泥中大量的雜菌，且降低了發酵過程中的乙酸濃度，由3439.3 mg/L降低至3017.8 mg/L，降低了14.0%。

圖2 己酸菌復壯不同輪次酸度的變化趨勢

表2 大曲處理方法對發酵的影響

表3 窖泥不同處理方法對己酸發酵結果的影響

2.4 己酸菌與酵母混合培養提高己酸產量

復壯的菌株JZ-79、JZ-80以及熱處理一輪的本廠優質老窖泥富集液，分別與酵母菌混合培養，并對以上3種菌進行混合培養。如圖3所示，與酵母菌混合培養后，活菌總數增加，而芽孢桿菌數除優質老窖泥外，沒有明顯差異。與酵母菌混合培養后，JZ-79、JZ-80、優質老窖泥富集液和3種菌混合培養的總酸包括己酸、丁酸以及乙酸含量都有所提高(圖4)，己酸含量分別由2795.9 mg/L、2930.4 mg/L、2110.5 mg/L和3067.5 m/L，提高至3204.3 mg/L、3439.3 mg/L、3025.7 mg/L和3365.6 mg/L；合成己酸的前體物質丁酸較原來也有明顯提高，分別達到6431.8mg/L、6371.8mg/L、5557.0mg/L和6590.6mg/L。隨后，在己酸菌培養基中提高酵母粉的添加量，己酸產量并未提高（數據未顯示），因此，己酸產量提高的原因不是酵母給予己酸菌提供的營養物質。與酵母菌混合培養產酸提高的主要原因正如文獻報道，可能是由于酵母菌的加入能夠改善己酸菌生長的厭氧條件，從而強化了由乙酸到丁酸和由丁酸到己酸的代謝途徑，進而提高了乙酸及丁酸的轉化率[1]。

圖3 己酸菌與酵母混合培養的菌數對比

圖4 己酸菌與酵母混合培養的菌數有機酸含量對比

3 結論

本研究從菌種復壯、大曲及窖泥處理方式和己酸菌與酵母混合培養等方面出發，增強己酸菌生長及產酸能力：經熱處理復壯的菌種，產酸能力明顯提高，JZ-80復壯兩輪、JZ-79和優質老窖泥富集液復壯一輪效果最好；經過熱處理的大曲粉和窖泥，既有效促進己酸菌的生長及產酸，同時還能為己酸菌快速適應窖池內環境奠定一定的基礎；酵母菌對己酸菌產己酸有較好的促進作用，且多種己酸菌混合培養產酸情況優于單一己酸菌培養。本研究通過不斷探索和實驗，己酸菌產酸能力有了很大的提升，為生產高質量的濃香型窖泥功能菌液提供了參考和依據。