甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮溶出過程的影響*

李芩萍 周 靜 李 敏 孔 俐 韓 進 張宇燕

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的根及根莖，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的功效［1］。甘草的主要有效成分是黃酮類化合物、甘草皂苷類和甘草多糖類化合物［2-3］，除具有腎上腺皮質激素樣作用外，還有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗心律失常、調脂等作用［4-10］。附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品，首載于《神農本草經》，列為下品，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效，用于亡陽虛脫及陽虛諸證［1］。配伍用藥是中醫特色之一，附子為回陽救逆要藥，但有毒，甘草味甘、性平，能緩能解，故臨床附子甘草多配伍應用［11］，如仲景四逆湯為治療傷寒少陰寒化證的基本方，甘草在方中亦有十分重要的意義。甘草既能降低附子的毒性，又能加強姜、附的功能，3味藥有機配伍，成為一首峻而不烈、功效卓著的回陽救逆名方。此經典搭配的增效減毒配伍關系引起醫藥研究人員的極大興趣并進行了大量研究。同時張仲景及歷代各醫家使用甘草附子配伍劑量各有特點，發揮最佳藥效［12-13］。本實驗采用紫外分光光度法，以甘草苷為對照品建立甘草黃酮的含量測定方法 ，觀察甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮的溶出過程及含量的影響，從分析化學探討甘草與附子等中醫藥配伍對成分溶出及含量變化的影響，為中醫藥配伍研究提供參考也為臨床用藥提供了依據。現報告如下。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 甘草藥材：購自浙江臨安市醫藥藥材有限公司，經鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖，批號20161025。附子藥材：購自浙江臨安市醫藥藥材有限公司，經鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，批號 20161210。甘草苷對照品（111610-200604）：中國藥品生物制品檢定所。

1.2 實驗儀器 TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。AG135型電子天平：上海精密科學儀器有限公司。DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗有限公司。FZ102微型植物試樣粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取甘草苷標準品2.2 mg，加60%乙醇溶解，并用乙醇定容至50 mL，制得濃度為44 μg/mL的對照品溶液。

2.2 單煎液、甘草與附子合煎液的制備 分別取甘草5 g，甘草 5 g與附子 5 g，加水 20倍，浸漬 30 min，煎煮60 min時間后定容至50 mL，取定容溶液0.4 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，作為甘草單煎，甘草與附子合煎供試液。

2.3 最大吸收波長的確定 精密吸取甘草苷對照品溶液0.5 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，以第1份為空白對照，于190～500 nm波長處掃描，結果在337 nm處有最大吸收。

2.4 標準曲線的制備 分別精密吸取甘草苷對照品溶液 0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，加 60%乙醇至 8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，在337 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，得線性回歸方程 y=0.0712x+0.0248 （R=0.9994）， 在 2.20～11.00 μg/mL范圍內甘草苷對照品濃度與吸光度呈線性關系。

2.5 精密度試驗 取“2.4”項下標準溶液系列中質量濃度為6.60 μg/mL的溶液，重復測定6次，以吸收度計算RSD，考察精密度。結果RSD=0.40%，精密度符合要求，說明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 分別取對照品溶液、甘草單煎液、甘草與附子合煎液，于各樣品制備后0、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h測定其吸光度，結果以吸光度計算RSD分別為0.24%、0.43%、0.55%，結果表明對照品溶液及各樣品溶液在6 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗 依照“2.2”項下供試液制備方法 制備甘草單煎液，甘草與附子合煎樣品液各5份。分別取甘草單煎液0.4 mL，甘草與附子合煎液0.4 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL。測定吸光度，計算甘草苷平均含量的RSD分別為1.51%、2.24%，結果見表1。

表1 甘草單煎液重復性試驗結果（%）

2.8 加樣回收試驗 取已知含量的供試品（分別單煎和合煎），加入甘草苷對照品，依照“2.4”項下方法測定吸光度，計算回收率，結果見表2、表3，平均回收率分別為98.06%、97.99%。

表2 甘草單煎液甘草苷加樣回收試驗

表3 甘草與附子合煎液甘草苷加樣回收試驗

2.9 甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮溶出過程的影響 分別取甘草5 g，按表4與附子不同比例配伍，加水 20 倍，浸漬 30 min，分別在煎煮 0、5、10、20、30、45、60、75、90 min 時間后定容至 50 mL，取定容0.4 mL，按照標準曲線項下測定并計算甘草苷含量。結果見表4、圖1，甘草與附子不同比例各配伍組，均隨著時間變化甘草黃酮溶出增加，溶出變化趨勢基本一致，且60 min后含量保持基本穩定。在同一時間點甘草與附子配伍后合煎比甘草單煎甘草苷的含量均降低，其中1∶3配伍時相同時間點甘草黃酮溶出明顯比其他配伍組低，其他配伍組變化比較接近。

表4 不同比例配伍后不同時間甘草苷含量的測定結果（%）

圖1 甘草與附子不同比例配伍后甘草黃酮動態溶出過程

3 討 論

甘草黃酮是甘草的主要有效成分，測定甘草黃酮的含量可以控制甘草生藥及含甘草制劑的質量［14-16］。二氫黃酮甘草苷是甘草黃酮的重要成分，在堿性條件下紫外最大吸收峰紅移，減少溶劑的干擾。本實驗采用樣品中加堿液的方法 ，在337 nm處測定吸光度，得線性回歸方程y=0.0712x+0.0248（R=0.9994），方法穩定，可靠，操作簡便。

甘草與附子配伍后，能明顯改變煎煮過程活性成分的含量變化。楊明等分析附子與甘草合煎后生成的沉淀，發現在生成的沉淀中除有酯型生物堿成分、甘草皂苷類成分，還有甘草黃酮類成分 （以甘草苷為代表）［17］。甘草苷屬二氫黃酮類成分，含有7-羥基，而苷元甘草素含有7，4’-二羥基，均顯酸性，易與附子中的生物堿（包括酯型生物堿）發生沉淀反應，從而可降低藥液中酯型生物堿含量，起到降低附子毒性的作用。本實驗研究表明，甘草與附子配伍后，甘草黃酮的溶出降低了，可能是甘草苷與附子中生物堿發生沉淀反應所致。本實驗研究甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮溶出過程的影響，結果同時也表明，甘草與附子不同比例各配伍組，隨著時間變化甘草黃酮溶出增加，60 min后含量保持基本穩定，且在同一時間點甘草與附子配伍后合煎比甘草單煎甘草苷的含量降低，不同配伍比例后含量動態變化規律基本一致，其中甘草與附子1∶3配伍在相同時間點甘草黃酮溶出明顯比其他配伍組低。實驗結果進一步證明了中醫臨床配伍的科學性與合理性，中醫藥配伍必須通過合理煎煮以降低毒性，增加療效，發揮其特長，同時也有助于探討甘草對附子的解毒作用的物質基礎，初步為臨床用藥劑量設計及新藥開發研究提供了依據。