四逆湯對高脂血癥合并動脈粥樣硬化兔模型血清炎性因子的影響*

王元紅 郁保生 雎世聰 鄒旭峰 龍 飄

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

動脈粥樣硬化（AS）主要累及動脈血管內壁，使其增厚變硬，管腔縮小，失去彈性，繼而內膜出現脂質或糖類、蛋白質堆積，在外界刺激下發生血管破裂或血栓形成，嚴重危害人類健康［1］。隨著我國生活水平提高，飲食結構改變，AS是眾多疾病 （諸如腦梗死、心肌梗死、脂肪肝、肝硬化、慢性腎病等）的形成、病發乃至惡化的重要原因之一。其發病率呈逐年增高的趨勢，并且呈年輕化發展［2］。因此，AS的臨床特征、病理機制及中、西藥研發已成為近年來研究熱點。高脂血癥（HLP）主要是機體脂肪代謝障礙而導致血清總膽固醇（TC）或三酰甘油（TAG）水平過高的一種病癥。HLP能夠誘發并促進AS的形成，是 AS的病理因素之一，兩者關聯密切［3］。藥理研究發現［4-5］，四逆湯及其各成分提取液均對超氧陰離子自由基有較強的清除能力，可通過抑制巨噬細胞、血管平滑肌細胞以及內皮細胞吞噬脂質，從而達到降脂的目的。本課題組前期研究發現［6］，四逆湯可明顯減緩AS程度，減輕內膜增厚水平，減少內膜的脂質斑塊面積，并減少凋亡泡沫細胞數量，繼而減少炎性因子的釋放，控制非特異性免疫反應。在此基礎上，筆者以四逆湯抗炎作用為切入點，觀察四逆湯對HLP合并AS兔模型血清相關炎性因子的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭雄性純種大耳白兔60只，3月齡，體質量（2±0.5） kg，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0005，湖南東創科技實驗動物有限公司。動物飼養于室溫（20±2） ℃、相對濕度（60±5）%的環境，采用12 h/12 h明暗光照。

1.2 實驗藥物 四逆湯由附子、干姜和炙甘草組成，購于湖南楚仁堂醫藥連鎖有限責任公司，批號：410075782，藥物劑量按 2∶3∶4（附子 15 g，干姜 23 g，炙甘草31 g）在湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑科制備成四逆湯浸膏（每1 g浸膏含生藥4.8 g）。阿托伐他汀鈣片，北京嘉林藥業股份有限公司，國藥準字號H19990258，批號：090203440。雙重蒸餾水由湖南中醫藥大學實驗室制備生產。

1.3 試劑與儀器 膽固醇（河南利偉生物藥業股份有限公司）；丙硫氧嘧啶（50 mg/片，上海朝暉藥業有限公司，國藥準字H31021082）；蛋黃粉（鄭州中成化工有限公司）；豬油（市售）；20%烏拉坦（上海化學試劑公司，生產批號：20150123）；TC、TG檢測試劑盒 （上海晶都生物技術有限公司，批號：JD1726、JD1721）；兔白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等 ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，CSB-E06903Rb）。JY3002型電子天平（瑞士METTER，AE100）；TGL16M 臺式高速冷凍離心機 （德國Eppendorf公司）、SB3200型超聲波清洗機（必能信超聲上海公司）、全自動生化分析儀 Roche Hitachi917型 （日本 Olympus公司）、BCD-226STC型冰箱（美國Thereto公司）、RM23235輪轉石蠟切片機（德國LEICA公司）。

1.4 分組與造模 將實驗兔適應性喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、阿托伐他汀組、四逆湯低劑量、四逆湯中劑量組、四逆湯高劑量組，每組10只。正常組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高膽固醇飼料 ［膽固醇1%，豬油5%，蛋黃粉10%，基礎飼料84%，將豬油加熱至液體狀，與膽固醇、蛋黃粉拌勻，每100 g高膽固醇飼料中加入20 mg丙硫氧嘧啶（10 mg/kg），一起加入普通飼料拌勻加工成丸劑］［7］造模。日食量按120～150 g分籠給予，飲水不限，連續喂養12周。每周定期稱體質量1次并記錄。成模標準：酶檢測兔血清血脂水平提高，其次通過病理切片觀察主動脈脂質斑塊情況。

1.5 給藥方法 造模成功后，各給藥組家兔按被試因素施加方法，連續4周給予藥物治療。西藥組按1 g/（kg·d）給予阿托伐他汀鈣片，磨碎拌入高脂飼料；四逆湯低、中、 高劑量組家兔將浸膏按 3.03、6.06、12.12 g/（kg·d）（按成人等效劑量折算［8］），拌入高脂飼料；模型組繼予高脂飼料；正常組繼予普通飼料，于早晨9∶00一次性飼喂。各組干預時間均為4周。

1.6 標本采集與檢測 1）IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的檢測。干預4周后，兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦麻醉固定，迅速剖開腹腔，取腹主動脈血2 mL，分別注入10%EDTA-Na 230 μL 試管、4 萬 U/mL 抑肽酶 40 μL試管，混勻，離心，取上清液，存于-20℃冰箱中。取冰凍血清標本，常溫融化，預估濃度。于空白孔、標準孔、待測樣品孔分別加入樣品稀釋液、標準品、待測樣品100 μL，不觸及孔壁。封板后置37℃溫育60 min。每孔加入100 μL工作液A，封板，孵育 35 min，洗板3次，甩干。每孔加入100 μL工作液B，封板，孵育60 min，洗板5次，甩干。每孔注入顯色劑90 μL，37℃避光顯色。每孔依序加50 μL終止液，終止反應。酶標儀在450 nm處測各孔光密度值（OD值）。2）動脈病理組織觀察。提取腹主動脈，游離上端至主動脈，剪取小段置于凍存管，液態氮保存，另取小段4%PF液固定，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm）、烤片、脫蠟、HE染色、封片，鏡下觀察主動脈形態學變化。

1.7 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較方差齊者LSD法，方差不齊時Tamhane′s T2法。不滿足正態性分布選擇秩和檢驗。P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 模型鑒定 見圖1，表1。HE染色示：正常組兔主動脈管壁結構清晰可見；模型組管壁內可見大量斑塊和脂質沉積，表明在造模后家兔主動脈管壁各層組織受到一定的損傷。造模第12周，經抽樣檢測，與正常組比較，模型組兔血清TC、TAG水平較高，差異有統計學意義（P<0.01），表明造模成功。

圖1 正常組、模型組家兔主動脈管壁組織形態學比較（HE染色，400 倍）

表1 兩組家兔血清TC、TAG水平比較（mmol/L，x±s）

2.2 各組家兔主動脈病理觀察結果 正常組兔主動脈壁各層次清楚，管腔內壁光滑、無脂質浸及，平滑肌細胞整齊排列，無斑點。與模型組比較，四逆湯高劑量組抑制泡沫細胞形成和平滑肌細胞的增生與重構效果顯著；四逆湯中劑量組血管炎癥浸潤程度降低，脂質斑塊排列整齊；阿托伐他汀組脂質斑塊較少，但主動脈內膜仍有大量泡沫細胞聚集；四逆湯低劑量組抗炎、降脂效果均不明顯。見圖2。

圖2 各組家兔主動脈組織形態觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組家兔血清 IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量比較 見表2。與正常組比較，模型組IL-6、TNF-α、IFN-γ 含量顯著升高（P<0.01），IL-10 顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，四逆湯高、中劑量組及阿托伐他汀組家兔 IL-6、TNF-α、IFN-γ 顯著降低 （P<0.05 或P<0.01），IL-10 顯著升高（P<0.01），四逆湯低劑量組IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量與模型組比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。

表 2 兩組兔血清 IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量比較（ng/L，x±s）

3 討 論

動脈粥樣硬化可歸入中醫學“胸痹”“心痛”“痰飲”等范疇。病機為心、脾、腎臟功能虛衰，以致痰濁、瘀血、水濕等病理產物停滯于脈中，阻塞脈道，全身氣血運行失常，屬本虛標實之病［9］。 如《石室秘錄·痰病》認為“肥人多痰，乃氣虛也。然補氣又不可純補脾胃之土，當兼補其命門之火”［10］，說明補足陽氣有助祛除痰瘀之邪，為治療脂質代謝類疾病開拓新思路。《素問·陰陽應象大論》［11］指出“陽化氣，陰成形”，若“陽化氣”功能減弱，易氣、血、津液運行不暢而變生瘀血、痰飲、水濕等病理產物，以致痰瘀互阻，動脈斑塊形成。 《醫理真傳》［12］謂四逆湯是“回陽之主方也”，君以附子溫腎暖陽，補先天欲絕之火種；臣以干姜入脾胃、心經，達溫中逐寒、回陽通脈之功，繼以甘草，緩其正氣，制其毒性。該方配伍藥精力專，心脾腎臟之本得以兼顧，則內生病理產物得以祛除。

動脈硬化是血管壁內膜發生纖維組織增生，粥樣病變是在動脈內膜處形成斑塊，斑塊的主要成分是平滑肌細胞、巨噬細胞、膠原纖維和蛋白多糖［13］。關于AS的發病機制，先后有脂質浸潤學說、損傷反應學說、炎癥反應學說、氧化應激學說等，但目前醫學界普遍認為AS是在多種因素作用下，發生病理改變而產生的［14］。

細胞因子是一種低分子量可溶性蛋白質，通過自分泌或旁分泌的方式作用于自身或其他細胞，分為促炎因子和抗炎因子。前者包括IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及近年來新發現的IL-23、IL-17等，主要表現為促炎作用；后者包括IL-4、IL-10、TGF-β等，主要表現為抗炎作用。其中，IL-6、TNF-α是機體產生的一類重要促炎因子，生物活性廣泛，在介導炎性反應及參與組織損傷與修復等方面發揮重要作用［15］。IL-6作為早期炎性反應的敏感指標之一，可促進單核/巨噬細胞活化，增強其吞噬殺傷作用［16］。TNF-α能夠增強AM的表達、誘導血小板的聚集，介導血管平滑肌細胞增殖和遷移，促進病變進展和斑塊形成［17］。TNF-α作為AS炎性反應的標記物，能有效體現炎癥活躍程度。IFN-γ是一種重要的免疫活化因子，主要由 Th1細胞和巨噬細胞分泌，可以促進固有細胞的免疫活化，如巨噬細胞、NK細胞。IFN-γ通過對相關炎癥介質調節，而誘導泡沫細胞形成，引起內皮損傷及功能降低，導致動脈粥樣硬化形成［18］。IL-10 由 CD4+淋巴細胞亞群（Th2）和巨細胞產生，它通過抑制IL-6、TNF-α的分泌，而減少炎性細胞因子的釋放以達到抗炎作用［19］。炎癥反應與以上各類因子的異常表達有關。

本實驗結果表明，在高脂及免疫損失誘導下，模型組 IL-6、TNF-α、IFN-γ 表達頗高，IL-10 表達頗低，四逆湯能降低HLP合并AS模型兔 IL-6、TNF-α、IFN-γ的表達，升高IL-10的表達。從四逆湯對兔血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-10的影響可以看出，四逆湯高劑量組效果最顯著，其次為四逆湯中劑量組和阿托伐他汀組，效果最低的是四逆湯低劑量組，表明四逆湯對炎性因子的調節具有劑量依賴性。另外，本實驗結果中IL-6與IL-10呈負相關，說明IL-6表達水平越高，IL-10表達水平越低，二者之間相互影響。筆者分析AS病變發生機制之一可能是IL-6與IL-10之間比例失衡導致的，提示四逆湯可能通過調節促炎和抗炎細胞因子間的平衡而減輕炎癥反應，達到抗動脈粥樣硬化的作用。四逆湯抗炎作用的具體機制今后將進一步從炎癥反應甚至蛋白表達方面研究。