升降散對膿毒癥大鼠心肌損傷保護的實驗研究

沈 蕓 胡冠宇 郭 健 錢風華 趙 雷 沈夢雯 丁純蕾 錢義明

（上海中醫(yī)藥大學岳陽臨床醫(yī)學院，上海 201203）

膿毒癥即宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而致的危及生命的器官功能障礙，也就是說當機體對感染的反應(yīng)損傷了自身組織和器官進而危及生命就稱為膿毒癥。新定義下的Sepsis 3.0強調(diào)了多器官功能衰竭，病情進展則危急甚至威脅到生命，比前兩個版本的定義更加適用于臨床診斷［1］。因其患病率和死亡率高，是急診及ICU重癥醫(yī)學研究方向的關(guān)注點［2］。心臟為機體的最重要的器官，是全身供血的能源泵，也是膿毒癥發(fā)生時最易受損的器官［3］。膿毒癥心肌功能障礙（SMD）發(fā)生率為64%，通常表現(xiàn)為心臟心室擴張、心肌收縮能力下降以及射血功能減退等［4］。盡管膿毒癥心肌損傷具有潛在可逆性特點，其病死率仍高于50%，使醫(yī)學界面臨巨大困難以及挑戰(zhàn)［5］。膿毒癥在中醫(yī)學中屬“溫病”“瘟疫”“熱毒”范疇。本課題組既往臨床實踐和基礎(chǔ)研究已證實升降散能改善膿毒癥患者臨床癥狀，降低膿毒癥大鼠炎癥指標，具有心臟保護作用。本研究旨在研究不同濃度的升降散對心肌細胞的保護作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）級遠交群（SD）雄性大鼠104只，體質(zhì)量200～150 g。由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK （滬）2012-0003。動物合格證號：2015000535015。標準條件下飼養(yǎng)大鼠，自由攝食飲水，1周后，適應(yīng)正常的大鼠納入本次實驗中。

1.2 試藥及儀器 本實驗中藥采用升降散凍干粉，升降散干凍粉為上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制作。制作具體步驟為：1）將升降散的4種組成藥物僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃按 2∶2∶1∶4 比例加 2000 mL 水武火先煎2 h，再次加水熬制2 h。2）文火煎煮濃縮至200 mL，用5層紗布過濾，收集提取液，將提取液干燥處理。3）以凍干粉形式保存，為后期使用做準備。Trizol（1596-026）購自 Invitrogen、DEPC 處理水（R1600）購自基爾頓生物，異丙醇（80109218）、無水乙醇（100092680）、氯仿（10023419）購自國藥集團；Elisa試劑盒：上海源葉生物科技有限公司。

1.3 分組與造模 按照隨機數(shù)字表法隨機將104只大鼠進行分組。正常組（n=8），膿毒癥模型組（n=24），升降散低劑量組（1.0 g/kg）（n=24），升降散中劑量組（2.0 g/kg）（n=24），升降散高劑量組（3.0 g/kg）（n=24）。膿毒癥模型組、升降散低劑量組、升降散中劑量組、升降散高劑量組又分為24、48、72 h 3個時間節(jié)點亞組，每個亞組大鼠均為8只。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥模型。大鼠以20 g/L戊巴比妥鈉麻醉后沿腹正中線作1.5 cm長的切口，在盲腸根部結(jié)扎盲腸。用10 mL注射器針頭在盲腸結(jié)扎遠端穿通2次形成盲腸漏。隨后，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)畢，立即予0.9%氯化鈉注射液1 mL腹腔注射抗休克［6］。

1.4 給藥方法 升降散低、中、高劑量組于造模前72 h及造模后6 h予相應(yīng)的升降散灌胃。正常組、模型組于術(shù)前72 h及術(shù)后6 h給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.5 標本采集及檢測 1）大鼠血清標本采集：按造模后24、48、72 h時間節(jié)點，先以2%苯巴比妥50 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)大鼠腹主動脈處采血約10 mL左右，用臺式離心機3000 r/min離心，離心15 min之后，取離心上清液，在-20℃的條件下貯存待用。采用ELISA法檢測大鼠血清肌鈣蛋白（cTnI）、腦鈉肽（BNP）水平。2）心臟組織標本的采集和心肌勻漿制備：按24、48、72 h時間節(jié)點，血清標本采集后，沿腹腔手術(shù)切口向上剪開胸腔，迅速取出心臟，隨即分離大鼠左心室心肌，用4℃的低溫氯化鈉溶液進行清洗，洗凈后于左心室采取心肌組織，在4℃的條件下用4%的多聚甲醛（pH=7.4）進行固定，固定后用光鏡觀察心肌形態(tài)，記錄心肌形態(tài)改變。3）死亡率觀察：大鼠造模后，按時間節(jié)點依次觀察大鼠是否存活。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示。若實驗數(shù)據(jù)符合方差齊性，則采用單因素方差分析及用LSD法進行多重比較各組間的差異；若實驗數(shù)據(jù)方差齊性不符合，則采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗及LSD法進行多重比較各組間的差異。Pearson相關(guān)分析兩變量之間的直線相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠病死率 見表1。模型組48、72 h病死率均為12.50%；升降散低劑量組大鼠24、48、72 h病死率分別為12.50%；升降散中劑量組大鼠48 h病死率為12.50%；升降散高劑量組大鼠48 h病死率為12.50%，各組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠不同時間段病死率［n（%）］

2.2 光鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu) 見圖1。造模后，與空白組比較，模型組大鼠24、48、72 h光鏡下見心肌細胞變性腫大，各細胞間排列疏松，心肌間質(zhì)組織水腫，心肌肌漿濃縮；升降散高劑量組治療后各時間節(jié)點，大鼠心肌細胞上述情況較模型組有不同程度的緩解。

圖1 光鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)（HE染色，100倍）

2.3 大鼠血清cTnI和BNP水平比較 見表2～表3。模型組大鼠造模后血清BNP逐漸升高，72 h達高峰，與空白組比較，24、48、72 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；與模型組比較，升降散低劑量組48、72 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；升降散中劑量組 24、48、72 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；升降散高劑量組24、48、72 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組大鼠造模后血清 cTnI逐漸升高，72 h 達高峰，24、48、72 h 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。與模型組相比較，升降散低劑量組48、72 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；升降散中劑量組 24、48、72 h 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；升降散高劑量組 24、48、72 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表2 各組大鼠BNP水平比較（μg/L，x±s）

表3 各組大鼠cTnI變化比較（ng/L，x±s）

3 討 論

升降散初見于明代龔廷賢《萬病回春·瘟疫門》，后收錄于《傷暑全書》，本方以僵蠶為君，蟬蛻為臣，姜黃為佐，大黃為使，具有解郁宣透，降火泄熱之功，多用于“表里三焦大熱”的溫熱火郁證，以三焦火郁、氣機失暢為病機特點［7］。僵蠶對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等有一定抑制作用；蟬蛻有解熱、抗過敏作用［8］；姜黃有抗炎、抗血凝和抗血小板聚集及保護心肌的作用［9-10］。 《素問·六節(jié)臟論》說“心者，生之本，神之變也，其華在面，其充在血脈”。中醫(yī)學認為機體是一個整體，人體自身具有完整性且與自然、社會環(huán)境具有統(tǒng)一性。構(gòu)成人體的各個部分、臟腑、官竅在結(jié)構(gòu)上不可分割，在功能上相互協(xié)調(diào)，相互為用，在病理上相互影響，疾病相互傳變。《內(nèi)經(jīng)·素問》曰“心者，君主之官也，神明出焉……主不調(diào)則十二官危，凡此十二官者，不得相失也”，是指心臟為君主之官，十二個器官之最大，主宰全身，主宰著人的精神意識思維活動，君主如果不能調(diào)暢神智，那么包括心臟在內(nèi)的十二臟器均將發(fā)生危險。這也充分體現(xiàn)了中醫(yī)學的整體觀念學說。由此思考，膿毒癥后期，常會發(fā)生多臟腑功能衰竭，無論是否心臟最早出現(xiàn)問題，但最終都會被累及，引發(fā)多臟腑功能衰竭，即西醫(yī)學中所說多器官功能障礙綜合征（MODS）。這與中醫(yī)學基礎(chǔ)理論完全相吻合。

膿毒癥心肌損傷發(fā)病機制并不是病原微生物直接侵犯心臟所致，而是與心肌抑制性炎癥因子和一氧化氮等有關(guān)，是在全身炎癥反應(yīng)綜合（SIRS）的基礎(chǔ)上發(fā)生和演變而來的［11］。膿毒癥發(fā)生時，機體產(chǎn)生大量炎癥因子（如 TNF-α、IL-6），形成級聯(lián)瀑布效應(yīng)，從而對心肌造成損傷，心功能障礙，心肌收縮功能下降［12］。目前膿毒癥所致心肌功能障礙的機制還并不明確。臨床上，cTnI具有快速、診斷窗口期寬等優(yōu)點，已取代磷酸肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）成為判斷心肌損傷的“金標準”［13］，BNP是一種多肽類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是臨床診斷心力衰竭的定量標志物，不僅反映左室收縮功能障礙，也反映左室舒張功能障礙、瓣膜功能障礙和右室功能障礙情況［14］。cTnI和BNP不僅可以作為診斷膿毒癥心肌損傷和心肌功能障礙的指標，也可以作為膿毒癥患者病情嚴重程度和預(yù)后的指標［15-16］。因此，本實驗選擇cTnI和BNP為心功能改善的評價標準。

本研究結(jié)果顯示，造模后模型組大鼠血清BNP逐漸上升，72 h達到高峰，說明大鼠膿毒癥心肌損害的程度隨時間的增加而逐漸加重。予不同劑量的升降散治療后大鼠血清BNP顯示出不同程度的降低，與模型組的BNP表達相比較，升降散各組指標下降明顯，且隨著升降散的濃度升高，大鼠血清BNP下降的程度越明顯；同樣cTnI與血清BNP呈現(xiàn)相同的趨勢，升降散灌胃治療后的各組大鼠cTnI下降明顯，且隨著升降散的濃度升高，大鼠血清cTnI下降的程度越明顯。雖然升降散高劑量組cTnI、BNP指標下降比升降散中劑量組更多，但差異并不明顯。這可能與最優(yōu)藥物濃度相關(guān)，還有待進一步研究。

綜上所述，升降散可以降低心肌損害功能障礙的指標，對膿毒癥大鼠心肌具有保護作用，且升降散濃度越高，心肌保護作用更加明顯，隨著濃度遞增，有療效遞進的相關(guān)性。但在臨床上運用，不僅要考慮到藥物的安全用量限制，還要顧及患者用藥的耐受性。本實驗為下一步臨床療效再評估做了部分前期工作，還需要我們進一步探究與證實。