調脂通脈中藥對動脈粥樣硬化兔模型內皮細胞標志物的影響

張 璐 孫 晴 郭書文 鄭 敏 蘇兆鐸 武建功 劉文臣 陳 曦

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；3.中日友好醫院，北京 100029；4.首都醫科大學，北京 100069）

動脈粥樣硬化（AS）病變斑塊的易損性是引起心腦血管急性事件的主要原因，“罪犯病變”一詞很好地描述了易損斑塊的特征。AS斑塊中主要病理特征是“脂質核心”，在病理因素刺激下，內皮細胞功能障礙，單核細胞分化成巨噬細胞表達多種模式識別受體（PRRs）［1］，巨噬細胞通過這些 PRRs（如清道夫受體）特異性的攝取ox-LDL，ox-LDL沉積，凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1（LOX1）激活，釋放炎癥因子，引起趨化因子MCP-1表達，趨化單核細胞，形成泡沫細胞，最終形成脂質核心［2］。可見，動脈內膜損傷是AS病變發生的始動環節。調脂通脈中藥由黃芪、當歸、決明子、生山楂、澤瀉、地龍、三七粉組成，來源于臨床經驗方，用于治療血脂異常，效果明顯。本實驗采用高脂飼料飲食加球囊損傷頸動脈內膜的方法復制兔動脈粥樣硬化模型，通過觀察內皮細胞標志物內皮素（ET-1）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、前列環素 2（PGI2）、血栓烷 A2（TXA2），探討調脂通脈中藥改善AS的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新西蘭大耳兔，體質量2.5～3.0 kg，3～4月齡，雄性，購自北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司，許可證編號SCXK（京）2010-0001，飼養于北京大學醫學部普通動物實驗室。飼養條件符合國家二級標準，單籠飼養，自由進食、水。

1.2 實驗藥物 調脂通脈中藥，組成：決明子、生山楂各 30 g，生黃芪 20 g，澤瀉 12 g，當歸、地龍各 15 g，三七粉6 g，共128 g。嚴格遵循口服顆粒劑制備工藝，按處方比例稱取藥材，前6味中藥加水煎煮2次，濃縮制成稠膏，將三七粉按比例加入上述稠膏，混勻，制成整粒，干燥，包裝，制成每劑20 g的顆粒（由北京中醫藥大學第三臨床醫學院提供）。按人體質量70 kg折算成兔等效劑量：7.3 g/（kg·d）。 阿托伐他汀鈣片（立普妥，輝瑞制藥有限公司提供，生產批號：1237304，規格20 mg/片），按臨床 20 mg/d 折算，兔等效劑量為 1.1 mg/（kg·d）。

1.3 動物飼料 高脂飼料（膽固醇1%，豬油3%，蛋黃粉10%，普通飼料86%）購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號：SCXK（京）2009-0008。實驗兔每只每日給予120 g高脂飼料，其余為普通飼料。

1.4 試劑與儀器 烏拉坦，500 g/瓶，國藥集團化學試劑北京有限公司提供。肝素鈉注射液，2 mL/支：12500 IU，由常州千紅生化制藥有限公司提供。鹽酸利多卡因注射液，5 mL∶0.1 g/支，上海朝暉藥業。注射用青霉素鉀（獸用），北京立時達藥業，160萬IU/支。ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司提供。2.0 mm×15 mm球囊導管，德國貝朗公司提供。球囊擴張壓力泵，BMW指引導絲，Y閥三通管，備皮刀，臨時動脈夾，眼科剪，眼科鑷，止血鉗（蚊式和普通），持針器，無菌帶線縫合針，不同規格的注射器。全自動生物化學分析儀，型號7600，日本日立公司；全封閉式組織脫水機，型號ASP300S，德國 Leica；石蠟組織包埋系統，型號 EG1150，德國Leica；手動輪轉式切片機，型號RM2235，德國Leica；H&E自動染色機，型號ST5020，德國Leica；全波長多功能酶標儀，型號22051164，瑞士Tecan。

1.5 模型制備 高脂飼料喂養2周后采用球囊損傷頸動脈方法復制AS模型［3-4］。術前12 h禁食，不禁水。稱體質量，給予25%烏拉坦注射液4 g/kg耳緣靜脈注射，麻醉成功標志：呼吸深慢均勻，四肢癱軟，角膜反射遲鈍。麻醉成功后耳緣靜脈推注肝素鈉200 IU/kg，防止凝血。動物仰臥位固定于無菌手術臺，電推剪脫毛，常規外科消毒，鋪巾，沿頸正中線切開頸部皮膚，暴露皮下組織，縱行逐層鈍性分離肌肉、筋膜，分離頸動脈血管，保護伴行的神經，區分頸總動脈、頸內動脈以及頸外動脈后，應用動脈夾結扎頸總動脈和頸內動脈，眼科剪斜向頸外動脈剪一“V”型小口，將2.5 mm×15 mm球囊經頸外動脈送入頸總動脈至主動脈弓處，給予合適壓力，重復操作3～4次，隨后抽空球囊，緩慢撤出導管，無菌縫合線結扎頸外動脈，撤出動脈夾恢復血流。檢查有無出血、滲血，逐層縫合肌肉、皮層。應用800000 IU青霉素肌肉注射3d預防感染。假手術組僅在解剖出頸總動脈后，用無菌縫合線在頸外動脈（遠心端處）打一死結，不進行球囊損傷。術后將動物置于加熱毯上，無菌敷料覆蓋。造模后繼續高脂飼養。

1.6 分組與給藥 隨機化原則分為正常組、假手術組、模型組、西藥組和中藥組，每組14只，在造模成功后第6周、第12周兩個時間點觀察指標變化情況。術后灌胃相應藥物，中藥組予調脂通脈中藥7.3 g/kg（顆粒劑用沸水溶成湯劑）；西藥組予阿托伐他汀1.1 mg/kg（研磨后0.9%氯化鈉注射液溶解）；正常組、假手術組和模型組不進行藥物干預，以相同體積蒸餾水灌胃；各組均為4 mL/kg，每日1次。

1.7 標本采集與檢測 1）血脂測定。分別在造模后6周和12周2個時間點將兔空腹禁食12 h，不禁水后，耳緣靜脈采血，3000 r/min，離心10 min，留取血清。全自動生物化學分析儀測定血清膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，計算動脈粥樣硬化指數（AI），AI=（TC-HDL-C）/HDL-C。 2）頸動脈病理組織觀察。在造模后6周和12周兩個時間點將實驗兔沿耳緣靜脈注入10mL空氣處死。剪開頸部皮膚，剝離肌肉組織，暴露頸動脈，剪取盡可能長的頸總動脈。將頸總動脈用生理鹽水反復沖洗后固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，連續切片，進行HE染色。3）肝臟病理組織觀察。取各組實驗在造模后6周和12周兩個時間點取肝臟標本，將肝臟組織固定于10%甲醛中，石蠟包埋，切片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固，封片后顯微鏡觀察，拍照，傳入病理圖像分析系統進行分析。 4）ET-1、eNOS、PGI2、TXA2 水平檢測。用ELISA試劑盒檢測血液中ET-1、eNOS、PGI2、TXA2水平，按試劑盒上的說明進行操作，觀察第6周、12周指標變化情況。

2 結 果

2.1 各組動脈粥樣硬化兔模型血脂水平比較 見表1。與正常組比較，模型組TC、LDL-C水平明顯升高，高脂血癥較為明顯（AI＞4）。西藥組和中藥組TC水平較模型組降低（P＜0.05）。LDL-C與TC變化趨勢相似，兩個藥物組的水平在不同時間點均較模型組降低（P＜0.05）。中藥組和西藥組之間未發現TC和LDL-C水平顯著差異，兩組TAG差異不顯著。此外中藥組和西藥組在12周時升高HDL-C水平（P＜0.05）。計算動脈粥樣硬化指數（AI），中藥組在12周時表現出最佳降低高脂血癥的效果（AI＜4），有效降低動脈粥樣硬化發生風險。

表1 各組血脂水平比較（x±s）

2.2 各組頸總動脈斑塊大小評價 見圖1。顯微鏡下觀察頸總動脈切片HE染色結果，如圖所示正常組頸總動脈結構完整，內膜無增厚，內皮下未見AS病變斑塊；中膜平滑肌細胞排列整齊。模型組可見管腔狹窄，AS斑塊向管腔內突起，管腔完整性被破壞，內皮細胞受損，可見泡沫細胞組成的脂質斑塊。與模型組比，治療組內皮細胞層緊密排列，連續性佳，平滑肌細胞未見增殖重構，提示治療有效。12周時，模型組頸動脈斑塊幾乎布滿整個管腔，管腔狹窄，平滑肌細胞排列紊亂，可見典型的脂質斑塊形成。斑塊底部肌層萎縮變薄。與模型組比較，兩個給藥組實驗兔的AS病變斑塊得到了不同程度的控制，中藥組和西藥組僅見少量斑塊，病變較輕。

2.3 各組肝臟形態學改變比較 見圖2。6周時，正常組肝小葉結構清晰中央靜脈居中，界面平滑，肝索排列規則，胞核結構清晰，細胞未見增生。高脂飲食喂養下的模型組肝臟組織中脂質積聚情況較正常組和假手術組增多。與模型組比較，中藥組和西藥組肝臟的脂質積聚情況明顯減輕。12周時，模型組可見彌漫性肝細胞脂肪變性，肝小葉結構破壞甚至炎細胞浸潤，肝細胞體積明顯增加，胞質內可見大量脂肪空泡，核被擠于細胞邊緣。中藥組肝細胞一定程度損壞，可見散在肝細胞脂肪變性，以小空泡脂肪變為主，肝小葉內少許炎細胞浸潤，未見肝內炎癥現象，脂滴明顯減少。少數可見有肝細胞碎屑樣壞死和炎細胞浸潤，但未見有纖維化改變。

圖1 各組頸總動脈切片（HE染色，200倍）

圖2 各組肝臟病理組織（HE染色，40倍）

2.4 血清內皮細胞標志物 ET-1、eNOS、PGI2、TXA2水平 見表2。6周時，與假手術組比較，模型組兔血清ET-1、TXA2 含量明顯升高，eNOS、PGI2 水平下降（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組和西藥組ET-1、TXA2含量下降，eNOS、PGI2 水平升高（P＜0.05）。12 周時，與假手術組比較，模型組兔血清內皮細胞標志物ET-1、TXA2含量分別升高了60.21%和 52.73%（P＜0.05），eNOS、PGI2水平下降了 55.61%和 42.83%（P＜0.05），提示模型組后期內皮損傷嚴重。與模型組比較，中藥組的 eNOS、PGI2水平升高了 58.16%和 31.73%（P＜0.05），ET-1、TXA2水平下降了 41.82%和 21.96%（P＜0.05），提示調脂通脈中藥能夠改善內皮細胞損傷。同時，西藥組也起到了相同的作用。

表 2 各組血清 ET-1、eNOS、PGI2、TXA2 水平比較（ng/L，x±s）

3 討 論

正常情況下，內皮細胞通過產生血管活性物質、生長因子、生長抑制因子維持血管壁的穩態［5］。如位于內皮細胞表面的TXA2和進入血流的PGI2、一氧化氮（NO），它們相互拮抗、相互協調，具有抗血栓形成、介導平滑肌細胞舒縮功能的作用［6］。NO是體內L-精氨酸在一氧化氮合酶（NOS）的催化下形成的，是十分重要的信使分子。NOS分為eNOS和誘導型一氧化氮合酶（iNOS），eNOS會在血管內產生NO與其協助調節血管功能，可與原生膜所包圍的細胞及與細胞內高基氏體膜聯合，是誘導NO生成重要的酶［7］。ET-1是一種由21個氨基酸殘基組成的活性多肽，是目前所知最強的縮血管物質［8］。內皮細胞損傷，可表現為血管舒張-收縮功能失衡，即NO水平降低和ET-1分泌增加，出現通透性和分泌功能障礙，甚至內皮剝脫［9］。此外，TXA2和PGI2，作為花生四烯酸代謝產物中生物活性最強的一對，分泌失衡也是發生AS的始動環節，因其參與了激活血小板，使血小板聚集和血管擴張［10］。內皮損傷，活性氧簇（ROS）增加，肌質網鈣三磷酸腺苷酶氧化增強，穩態失衡，引起內質網應激、代謝功能失調、自由基形成等多重反應［11］。本實驗發現，6周、12周兩個時間點，動脈粥樣硬化兔模型血液中eNOS、PGI2表達下降，ET-1、TXA2水平升高，表明AS模型出現內皮功能障礙，而兔模型通過調脂通脈中藥干預后，能夠降低ET-1、TXA2水平，同時升高 eNOS、PGI2水平，改善了內皮細胞收縮-舒張功能障礙。因此，我們推測調脂通脈中藥能夠改善內皮細胞損傷，保護血液和組織之間的這層“屏障”。

“膏脂學說”是中醫認識本病的重要依據。《靈樞·衛氣失常》中提到“眾人血與氣不能相多，膏者多氣，氣者多熱；脂者，其血清，氣滑少”。可見氣血理論在本病治療中具有指導意義。中醫學認為，“人以脾胃為本，蓋人受水谷之氣以生”。脾是淋巴器官，具有重要的免疫功能。脾氣虛會造成血脂異常，這是一個多臟腑功能失調作用的結果，脾系統的功能不僅僅局限于西醫解剖學中的脾臟，還涉及消化系統、血液、免疫、神經功能等。因此，脾氣虛可使免疫系統功能下降，而這也正是引起動脈粥樣硬化形成的重要因素之一。

在多臟腑功能失調中，最重要的是脾氣虛會影響肝的疏泄功能，肝失疏泄使膽汁聚集，形成結石阻滯膽道。膽道受阻會降低凈濁化脂的功能，進而引起血脂異常。氣血關系密切自不必說，氣為血帥，血隨氣行。肝失疏泄引起氣滯不行或脾氣虛推動無力，會引起血瘀。脾虛不運清濁，津液停滯，濕邪內聚而致痰生。《臨證指南醫案》中說“濕為重濁有質之邪，若從外而受者，皆由地中之氣升騰；若由內而生者，皆由脾陽之不足”。可見濕邪與脾虛關系密切。濕性黏滯，阻礙氣機，化而為痰。明代王絕在《明醫雜著》中所言“痰者，病名也，人之一身，氣血清順則津液流通，何痰之有？唯氣血濁逆，則津液不清，熏蒸成聚而變為痰焉”。《景岳全書·痰飲》中也提到“痰即人之津液，無非水谷之所化。此痰亦既化之物，而非不化之屬也。但化得其正，則形體強，營衛充，而痰涎本皆血氣；若化失其正，則臟腑病，津液敗，而血氣即成痰涎”。氣虛、血瘀、痰濁，會引起血液流變異常，血流不暢使血液呈黏滯、濃稠狀態，引起血脂增高。所以痰濁凝聚、結于心脈亦是動脈粥樣硬化形成的關鍵病機。

從現代藥理學角度看，血脂異常會引起血漿成分發生改變，如血小板、ET-1，動脈收縮，血管內正常的代謝受到抑制，引起脂質沉積［12］。筆者認為，動脈粥樣硬化的治療關鍵是健脾益氣為本，以去濁活血通絡為標。以此為依據遴選組成的中藥復方——調脂通脈中藥，標本兼治，臨床長期療效較好，課題組前期實驗研究驗證其作用效果明顯，能夠降低AS模型血清炎癥因子、增加抗炎因子如IL-10、TGF-β的表達，還能增加ApoE-/-小鼠斑塊內自噬基因的表達［13-15］。本實驗對AS兔模型內皮細胞標志物eNOS、ET-1等藥效指標進行評價，研究表明調脂通脈中藥作用明顯，能夠起到降低血脂、改善內皮功能紊亂的作用，為AS的預防和治療提供新的思路。