高效液相色譜法測定紅臀軟膏中維生素A的含量

王文郁 楊釗

紅臀軟膏為江蘇省淮安市第一人民醫院生產的軟膏劑,用于治療和預防嬰幼兒紅臀［1-5］。主要成分為魚肝油, 維生素A為魚肝油的有效成分, 測定維生素A的含量, 可為控制紅臀軟膏的質量以及臨床用藥提供科學參考依據［6-10］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 METTLER PL602-S電子天平；METTLER AB204-S電子天平；KH-300B型超聲波清洗器儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。

1.2 試劑 甲醇為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。對照品：維生素A醋酸酯(中檢院, Vitamln A Acetate ,批號：100368-201301, 含量：按C22H32O2計, 本品每1克中含維生素A醋酸酯343 mg)。樣品：紅臀軟膏(淮安市第一人民醫院 , 批號 160801、160803、160728, 規格：20 g/支 )。魚肝油, 陰性樣品(淮安市第一人民醫院, 不含魚肝油)。

2 方法與結果

2.1 色譜方法

2.1.1 含量測定 按照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)測定。色譜條件與系統適用性試驗采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水(90∶10)為流動相, 柱溫為35℃, 流速為1.0 ml/min, 檢測波長為328 nm。維生素A醋酸酯峰與相鄰雜質峰的分離度應符合要求。

2.1.2 測定法 精密稱取本品1 g, 置500 ml分液漏斗中,用三氯甲烷-水(5∶2)振搖提取4次, 1 ml/次, 合并三氯甲烷液, 三氯甲烷液于60℃水浴上蒸干, 殘渣加正己烷溶解并轉移置20 ml量瓶中, 用正己烷稀釋至刻度, 搖勻, 作為供試品溶液, 精密量取10 μl注入液相色譜儀, 記錄色譜圖；另取維生素A醋酸酯對照品適量, 精密稱定, 加正己烷溶解并定量稀釋制成每1毫升中含6 μg溶液, 作為對照品溶液, 同法測定。按外標法以峰面積計算, 即得。每1克中含維生素A應為 87.72～113.52 μg。

2.2 線性與范圍 精密稱取維生素A醋酸酯對照品0.9251 g(含維生素A醋酸酯317.3093 mg)置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 精密吸取2 ml置100 ml量瓶中, 即得對照品貯備液①, 維生素A醋酸酯濃度為126.9238 μg/ml；從對照品貯備液①精密吸取25 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 即得對照品貯備液②, 維生素A醋酸酯濃度為63.4619 μg/ml；從對照品貯備液②精密吸取4 ml,置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 即得對照品貯備液③, 維生素A醋酸酯濃度為5.0769 μg/ml；分別精密量取對照品貯備液①0.5 、1、2、5、10 ml置50 ml量瓶中, 用正己烷稀釋至刻度, 搖勻。各精密量取10 μl注入液相色譜儀, 記錄色譜圖。各溶液濃度值及其峰面積見表1。以峰面積值(Y)對維生素A醋酸酯濃度(X)進行線性回歸, 求得回歸方程：Y=90.079X-0.4124, R=0.9999。見圖1。維生素A醋酸酯在1.269～25.380 μg/ml范圍內, 峰面積值與進樣濃度有良好的線性關系。

表1 各線性溶液濃度值及其峰面積

2.3 準確度 加樣回收試驗：采用向魚肝油與陰性樣品中加入已知量的維生素A醋酸酯對照品進行測定。根據藥品質量標準分析方法驗證指導原則(《中國藥典》2015年版四部通則9101), 紅臀軟膏中維生素A醋酸酯含量約為0.01%, 回收率限度應為85%～110%。

精密稱取魚肝油5.0434 g、陰性樣品2.4600 g, 置500 ml分液漏斗中, 加三氯甲烷-水(5∶2)振搖提取4次, 取三氯甲烷層, 合并每次三氯甲烷層, 棄去水液, 置蒸發皿中, 于60℃水浴上蒸干, 蒸干后殘渣加正己烷溶解并轉移至50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 作為供試品溶液貯備液①。

各精密量取供試品貯備液①5 ml, 置9個50 ml量瓶中。3個量瓶一組, 每組分別加入對照品貯備液②4、5、6 ml, 用正己烷稀釋至刻度, 搖勻。按上述色譜方法測定。見表2。

表2 準確度試驗結果

精密量取對照品貯備液②5 ml置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 精密量取10 μl注入液相色譜儀,連續進5針, 記錄色譜圖。精密量取供試品貯備液5 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 即得本底值濃度的樣品, 精密量取10 μl注入液相色譜儀, 記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算。

2.4 專屬性 分別精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液(采用陰性樣品配制, 方法同供試品溶液)及正己烷溶劑各10 μl, 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖。精密量取對照品貯備液②5 ml置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 作為對照品溶液。同精密稱取魚肝油①0.2118 g、②0.2123 g分別置20 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度搖勻。魚肝油①以外標法按峰面積計算得：魚肝油①的維生素A醋酸酯的含量為0.5321 mg/g；魚肝油②以外標法按峰面積計算得：魚肝油②的維生素A醋酸酯的含量為0.5317 mg/g；魚肝油的維生素A醋酸酯的含量平均值為0.5319 mg/g。

精密稱?、亵~肝油0.1926 g, 不含魚肝油的陰性樣品0.8416 g, ②魚肝油0.1931 g, 不含魚肝油的陰性樣品0.8089 g,分別置500 ml分液漏斗中, 用三氯甲烷-水(5∶2)振動搖提取四次, 合并每次的三氯甲烷液, 置同一蒸發皿中于60℃水浴上蒸干, 將蒸干后的殘渣用正己烷溶解, 并轉移置20 ml量瓶中, 加正己烷定容至刻度, 搖勻。

①魚肝油0.1926 g與不含魚肝油的陰性樣品0.8416 g混合；以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.5319 mg/g；②魚肝油0.1931 g與不含魚肝油的陰性樣品0.8089 g混合, 以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.5321 mg/g維生素A醋酸酯的含量平均值為0.5320 mg/g。

精密稱取樣品①1.4337 g、②1.4194 g(批號：160801),①0.9785 g、②0.9567 g(批號：160728)、①0.9976 g、②0.9779 g(批號：160803)分別置500 ml分液漏斗中, 用三氯甲烷-水(5∶2)振搖提取四次, 合并每次的三氯甲烷液, 置同一蒸發皿中于60℃水浴上蒸干, 將蒸干后的殘渣用正己烷溶解, 并轉移置20 ml量瓶中, 加正己烷定容至刻度, 搖勻。

①以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0812 mg/g；160801②以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0815 mg/g維生素A醋酸酯的含量為0.0814 mg/g；160728①以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0796 mg/g；160728②以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0801 mg/g；維生素A醋酸酯的含量為0.0798 mg/g；160803①以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0821 mg/g；160803②以外標法按峰面積計算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0818 mg/g；維生素A醋酸酯的含量為0.0820 mg/g。供試品溶液在對照品溶液主峰保留時間相同處有相應色譜峰(18.6 min), 理論板數按維生素A醋酸酯峰計為11968；陰性樣品溶液及溶劑在與對照品相應的保留時間無色譜峰出現,說明陰性樣品及溶劑無干擾。

2.5 耐用性 對照品溶液穩定性：精密量取對照品貯備溶液①2 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 制成1 ml含維生素 A醋酸酯 5.0769 μg溶液, 在 0、2、4、8、24 h進樣, 測定對照品溶液穩定性。見表3。結果表明,對照品溶液在24 h內穩定。

表3 供試品溶液穩定性試驗結果

3 小結

按照藥品質量標準分析方法驗證指導原則(2015年版《中國藥典》四部通則9101)要求, 進行方法驗證試驗。結果表明, 本法準確可靠, 可用于紅臀軟膏的含量測定。