F18大腸桿菌抗性型與敏感型蘇太斷奶仔豬十二指腸組織比較轉錄組分析

吳正常，馮海悅，黃焱杰，吳麗思，吳圣龍,2，包文斌,2*

(1. 揚州大學動物科學與技術學院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009； 2. 揚州大學教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，揚州 225009)

仔豬腹瀉是許多規?；B豬場最為常見的一類疾病，對養豬生產造成了嚴重的經濟損失[1]，其中F18大腸桿菌(E.coliF18)是目前規?；B豬場仔豬細菌性腹瀉最普遍、致病性較強的病原之一[2]。F18大腸桿菌致病機理已經相對清楚，主要通過菌毛特異性的吸附小腸上皮細胞表面相應的受體，從而定居，大量繁殖，產生的腸毒素進入小腸細胞內引起一系列免疫反應和病理效應，進而刺激腸上皮細胞分泌大量液體進入腸腔，引起仔豬腹瀉。因此，仔豬抵抗F18大腸桿菌感染，關鍵在于小腸上皮細胞F18大腸桿菌受體表達與否以及機體腸道固有免疫能力的差異。目前，研究發現，α(1,2)巖藻糖轉移酶(alpha (l,2) fucosyltransferase)基因1(FUT1)是控制F18菌毛與小腸黏膜受體結合的重要候選基因，其中編碼區M307位點G/A突變(丙氨酸→蘇氨酸)作為豬抵抗F18大腸桿菌的一個遺傳標記[3-4]，該標記在國外豬品種(如杜洛克豬)已經成功實現抗病育種(申請專利號：443766)。然而，FUT1基因標記在20多個中國國內地方豬品種中呈現極端偏態分布[5-9]，由此表明，適用于引進豬種的FUT1基因標記并不適用于中國地方豬品種的抗病育種。本課題組前期以中國地方品種梅山豬斷奶仔豬為研究對象，利用F18菌株感染及一系列驗證試驗獲得了確證的梅山豬F18大腸桿菌抗性與敏感型斷奶仔豬個體[10]，通過十二指腸轉錄組測序分析篩選出F18大腸桿菌抗性相關的重要調控通路(TLRs信號通路)及CD14等關鍵基因，沒有發現巖藻糖轉移酶基因如FUT1及其所在的通路發揮重要的調控作用[11]。由此進一步推測，中外豬品種抵抗F18大腸桿菌感染的遺傳基礎和調控機制存在一定的差異。本課題組前期建立了含有國內地方和外來血統的培育品種—蘇太豬(杜洛克×梅山豬)F18大腸桿菌抗性型和敏感型家系群體，運用細菌與小腸上皮細胞體外黏附試驗嚴格鑒定并篩選出了蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型的全同胞個體[12-13]，并且利用該樣本在細胞水平和個體水平上進行了F18大腸桿菌抗性相關候選基因或蛋白質的功能驗證[14-20]。

為了系統揭示蘇太豬F18大腸桿菌抗性調控的遺傳基礎和分子機制，本研究對蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個體十二指腸進行轉錄組測序，通過生物信息學方法重點篩選重要調控通路和候選基因，利用qPCR驗證重要候選基因分別在梅山豬和蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個體十二指腸組織中的差異表達情況，同時，在細胞水平上利用F18大腸桿菌菌體(F18ab、F18ac)分別刺激豬小腸上皮細胞系IPEC-J2，利用qPCR和Western blot檢測重要候選基因和蛋白的表達變化，繼續探討蘇太豬和梅山豬在抵抗F18大腸桿菌感染過程中分子機制的差異，為進一步闡明國內外豬品種對F18大腸桿菌抗性的遺傳基礎及其差異提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

蘇太豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型斷奶仔豬來自于課題組前期建立的蘇太豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型資源家系群體，前期已經通過V型分泌系統展呈功能性黏附素和受體結合試驗技術嚴格篩選出E.coliF18抗性型與敏感型全同胞配對個體各3頭[12-13]，用于本試驗的轉錄組測序分析以及組織表達分析；此外，課題組前期采用F18ab和F18ac菌株口服攻毒試驗，并利用仔豬腸道E.coliF18細菌檢測、細菌計數以及小腸上皮細胞黏附試驗獲得了確證的梅山斷奶仔豬E.coliF18抗性型與敏感型個體[10]，各選取3頭用于本試驗的組織表達分析；蘇太和梅山E.coliF18抗性型與敏感型斷奶仔豬屠宰后，取十二指腸組織置于1.5 mL無酶管中，現場液氮保存，然后轉移至-80 ℃冰箱保存備用。小腸上皮細胞系IPEC-J2由美國賓夕法尼亞大學惠贈。

1.2 試驗材料與試劑

豬小腸上皮細胞系IPEC-J2、大腸桿菌F18ab、F18ac菌株均由美國賓夕法尼亞大學所贈；胎牛血清FBS、培養液DMEM/F12、胰酶Trypsin-EDTA Solution、細胞培養孔板均購自Gibco公司(美國)；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司(美國)；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司(中國，南京)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒購自南京凱源科技發展有限公司(中國，南京);一抗TLR5 (1∶800)、FUT2 (1∶600)、IL-1β (1∶600)購自Abcam(Cambridge，UK)；二抗(IgG-HRP，1∶3 000)購自Jackson(PA，USA);切膠回收試劑盒、無內毒素質粒抽提試劑盒購自天根生物技術有限公司(中國，北京)。

1.3 RNA提取、cDNA文庫建立以及上機測序

使用Trizol法對樣品進行總RNA的抽提。進行RNA樣品質量檢測，包括首先利用Nanodrop檢測RNA的濃度和純度(OD260 nm/OD280 nm)，然后通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳來檢測RNA是否有降解或污染，最后利用Qubit和Agilent2100分別對RNA濃度和完整性進行精確檢測。在此基礎上，通過Oligo dT富集、cDNA合成、末端修復加接頭和PCR擴增來進行cDNA文庫建立，最后利用Hiseq4000上機測序，數據量為6G clean data/樣本。

1.4 生物信息學分析

1.4.1 差異表達基因分析 根據Fold change(差異倍數)和P-value(顯著水平)兩個指標對差異表達基因進行篩選，閾值設定一般為|log2(Fold change)|>1且P-value<0.005。不同分組間差異表達基因的整體分布情況可以用火山圖來表示，所用分析軟件為DESeq(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)。

1.4.2 差異表達基因的功能富集與注釋 利用GOSeq[21]軟件挖掘差異表達mRNA的主要生物學功能，包括分子功能(molecular function)、細胞組成(cellular component)、生物學過程(biological process)；利用KOBAS[22]軟件分析差異表達mRNA 的代謝通路注釋(KEGG Pathway)。

1.5 F18大腸桿菌刺激豬小腸上皮細胞IPEC-J2

將大腸桿菌F18ab、F18ac菌株分別接種于LB培養液，200 r·min-1搖菌12 h，3 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體，沉淀并離心，反復操作3次。菌體最后用細胞培養液稀釋至1.0×109CFU·mL-1，按每孔1 mL的量加入細胞培養孔，每組有3個平行樣，4 h后收集細胞，菌體刺激的IPEC-J2細胞作為試驗組，未作處理的IPEC-J2細胞作為對照組。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

根據GenBank數據庫已公布的豬FUT2、IL-1β和TLR5基因序列，利用Primer5.0軟件設計Real-time PCR引物(表1)，以GAPDH和β-actin為內參基因，所設計引物均跨外顯子，以避免PCR產物中有DNA污染，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

根據反轉錄試劑盒說明書進行操作，以RNA為模板進行cDNA合成：反應體系中含2 μL 5 × qRT SuperMix II，500 ng總RNA，無酶水補足至10 μL。反應程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。Real-time PCR反應體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL，PCR上下游定量引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，0.5 μL ROX Reference Dye II(50×)，2 μL cDNA，ddH2O 9 μL。每個樣本設置3個重復。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個循環；利用擴增曲線和熔解曲線分析擴增效果及引物的特異性，具體程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

表1熒光定量PCR所用引物信息

Table1Primerinformationsforreal-timePCR

基因GeneGenBank登錄號GenBank accession number引物(5'→3')Primer產物長度/bpLengthTLR5AB208697.2F: GGTTCTCGCCCACCACATTA158R: GGGTCCCAAAGAGTCGGAAGFUT2U70881.2F: AATCCCTGACCTCACTCCGTG123R: CGGAACTACAACTGCTGGCCIL-1βNM_001005149F: TGATTGTGGCAAAGGAGGA63R: TTGGGTCATCATCACAGACGGAPDHNM_001206359.1F: ACATCATCCCTGCTTCTACCGG188R: CTCGGACGCCTGCTTCACβ-actinXM_003124280.3F: TGGCGCCCAGCACGATGAAG149R: GATGGAGGGGCCGGACTCGT

F. 上游引物；R.下游引物

F.Forward primer; R.Reverse primer

1.7 蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測

以F18菌體刺激前后的豬小腸上皮細胞IPEC-J2為樣本，使用全蛋白抽提試劑盒提取細胞和組織總蛋白，并通過BCA試劑盒檢測蛋白含量，使蛋白質水平標準化。SDS-PAGE(10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)：取10 μL蛋白質上樣，160 V跑膠70 min。Western blot(蛋白印跡)：蛋白質轉移到PVDF(聚丙烯二氟乙烯)膜上，與相關抗體進行免疫印跡，TLR5 (1∶800)、FUT2 (1∶600)、IL-1β (1∶600)抗體作為一抗，兔原抗體IgG(Abcam, UK, 1∶5 000)作為二抗，β-actin (1∶4 000)作為參照。

1.8 數據統計分析

對內參基因GAPDH和β-actin的Ct值取幾何平均數，并采用2-ΔΔCt法[23]處理相對定量的結果，用內參基因對表達水平進行均一化。利用SPSS 16.0軟件的一般線性模型(general linear model, GLM)對基因和蛋白在菌體刺激細胞前后、抗性型與敏感型個體十二指腸組織中的表達差異情況進行比較分析。

2 結 果

2.1 蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型個體十二指腸轉錄組分析

3頭蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型(SR1、SR2、SR3)個體與3頭敏感型個體(SS1、SS2、SS3)十二指腸組織樣本和測序數據均經過嚴格的質量檢測后，RNA總量、完整性以及純度均符合測序標準(RIN≥6.5；OD260nm/OD280 nm≥1.8；28S/18S≥1.0)，本研究運用RNA-seq技術獲得蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個體十二指腸的轉錄本，3頭抗性型(SR1、SR2、SR3)與3頭敏感型(SS1、SS2、SS3)個體分別獲得1 324 600、1 405 100、1 321 800、1 464 900、1 371 900、1 266 400條raw reads，比對到豬參考基因組(Sscrofa10.2)上，81.2%～82.7%的reads匹配到參考基因組上，其中68.5%～71.8%屬于特異性匹配；為了進一步探究蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個體十二指腸的差異表達轉錄本，利用經隨機方差模型修正后的T-檢驗(RVM-T test)計算測序所檢測到的基因表達的顯著性水平(P-value)，篩選出兩組間差異表達mRNA共238個，其中抗性組上調差異表達基因(differential expression genes, DEGs)112個，下調DEGs 126個(部分DEGs見表2)。

表2蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型個體十二指腸部分差異表達基因

Table2PartialdifferentialexpressiongenesinduodenumofSutaiE.coliF18-resistantandE.coliF18-sensitiveweanedpiglets

轉錄本Transcript基因名稱Gene nameSR_FPKMSS_FPKMlog2(fold change)P值P-valueNM_214055.1IL-1β1.335 800.567 331.235 440.029 10NM_001206441.1TAP23.912 611.841 341.087 380.002 80NM_001123202.1TLR57.831 924.738 400.724 970.015 25NM_214069.1FUT22.534 667.684 35-1.600 130.000 15NM_001123127.1HSP7051.963 3024.470 101.086 470.009 55XM_005666775.1CXCL115.540 312.728 211.022 010.019 50NM_001038004.1MMP94.410 832.189 531.010 430.006 20NM_001160080.1DGAT238.04 8619.714 100.948 610.017 90NM_001244717.1SLC13A277.624 3046.487 900.739 650.012 55NM_001206402.1TRIM3112.423 8029.62 12-1.253 520.000 20XM_003482441.2SCLT12.562 954.236 45-0.725 050.049 70

差異倍數表示F18大腸桿菌抗性組(SR)/F18大腸桿菌敏感組(SS)

Fold change meansE.coliF18-resistant group (SR) /E.coliF18-sensitive group (SS)

2.2 蘇太斷奶仔豬十二指腸差異表達基因的功能注釋

差異表達基因的功能注釋結果表明，大部分基因主要顯著參與14種GO分類，其中涉及到免疫系統過程(immune system process)、免疫應答(immune response)、海藻糖酶活性(trehalase activity)等，具體見表3；篩選的差異表達基因主要顯著參與20個pathway通路，其中涉及到免疫相關通路如Toll樣受體信號通路(toll-like receptor signaling pathway)(包括TLR5、IL-1β基因)和糖脂類通路(glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series)(包括FUT2基因)，見表4。

2.3 F18大腸桿菌刺激蘇太斷奶仔豬小腸上皮細胞IPEC-J2后重要候選基因表達變化

基于轉錄組測序和功能注釋分析，本研究篩選出大腸桿菌F18受體形成相關基因FUT2[29]，以及免疫調控相關基因IL-1β和TLR5[28]。為了進一步探究這3個重要候選基因(FUT2、IL-1β和TLR5)表達水平與F18大腸桿菌感染的關系，分別通過F18ab、F18ac菌體刺激小腸上皮細胞IPEC-J2，并利用qPCR和Western blot檢測FUT2、IL-1β和TLR5表達變化。結果顯示(圖1)，F18ab和F18ac菌體刺激小腸上皮細胞IPEC-J2后，3個基因均表現出顯著的上調表達(P<0.05)，進一步的Western blot驗證結果和qPCR相一致(圖2)。

2.4 重要候選基因在斷奶仔豬F18抗性型與敏感型個體的差異表達分析

為了進一步驗證轉錄組篩選出來的重要差異表達基因(FUT2、IL-1β和TLR5)，本研究在課題組前期獲得的梅山豬和蘇太豬斷奶仔豬F18抗性型與敏感型個體十二指腸組織中進行qPCR驗證，結果顯示，TLR5基因在蘇太豬抗性組十二指腸組織中表達水平極顯著高于敏感組(P<0.01)，IL-1β顯著高于敏感組(P<0.05)，而FUT2在敏感組中極顯著高于抗性組(P<0.01)(圖3)；TLR5、IL-1β基因在梅山豬抗性組十二指腸組織中表達水平均極顯著高于敏感組(P<0.01)，而FUT2在梅山豬抗性組和敏感組中表達水平無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

表3蘇太斷奶仔豬十二指腸差異表達基因的GO功能富集分析

Table3Geneontology(GO)enrichmentanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinduodenumofSutaiweanedpiglets

GO登錄號GO accession No.名稱DescriptionP值P value基因名稱Gene nameGO:0008009趨化因子活性Chemokine activity0.015 022CXCL9, AMCF-II, CXCL13GO:0042379趨化因子受體結合Chemokine receptor binding0.015 022CXCL11, CCL20, CXCL9, AMCF-II, CXCL10, CXCL13GO:0004555α,α-海藻糖酶活性alpha,alpha-trehalase activity0.015 022TREH, GBP7, LOC100620987GO:0015927海藻糖酶活性Trehalase activity0.015 022TREH, LOC100620987, GBP7GO:0002376免疫系統過程Immune system process0.015 022CD2, LOC100621671, AMCF-II, IL1β, CCL20, CXCL13, CXCL9, CXCL10, CXCL11GO:0005991海藻糖代謝途徑Trehalase metabolic process0.021 547TREH, LOC100620987, GBP7GO:0005525GTP結合GTP binding0.021 547PCK1, GIMAP2, GBP5, EEF1A1, GBP6, LOC100516289, GBPGO:0032561甲脒基核糖核苷酸結合Guanyl ribonucleotide binding0.021 547TAP2, FUT2, LOC102161784GO:0019001甲脒基核苷酸結合Guanyl nucleotide binding0.021 547GBP5, TAP2, FUT2, PCK1, LOC102167556, RABGO:0005984二糖代謝Disaccharide metabolic process0.021 547TREH, LOC100620987, GBP7GO:0006955免疫應答Immune response0.021 547CCL20, AMCF-II, IL1β, CXCL13, CXCL11, CXCL10GO:0001664G-蛋白耦合受體結合G-protein coupled receptor binding0.021 547CXCL13, AMCF-II, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL20GO:0009311寡糖代謝途徑Oligosaccharide metabolic process0.027 832INMT, TREH, GBP7GO:0005125細胞因子活性Cytokine activity0.033 923CXCL11, CCL20, CXCL9, AMCF-II, CXCL10, CXCL13

表4蘇太斷奶仔豬十二指腸差異表達基因的KEGG通路富集分析

Table4KEGGpathwayanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinduodenumofSutaiweanedpiglets

Pathway名稱Pathway descriptionPathway登錄號Pathway accession No.P值P value基因名稱Gene name亞油酸代謝Linoleic acid metabolismssc005910.000 000 725ALOX12, 12-LOX, ALOX15, PLA2G2D, CYP3A29維生素代謝Retinol metabolismssc008300.000 961 878BCMO1, CYP2C49, CYP1A1, CYP3A46, CYP3A88花生四烯酸代謝Arachidonic acid metabolismssc005900.001 851 731GPX2, ALOX12, 15-LOX, ALOX15, PLA2G2D

(轉下頁 Carried forward)

Control表示對照組；F18ab表示F18ab菌體刺激IPEC-J2；F18ac表示F18ac菌體刺激IPEC-J2。*. P<0.05Control represents the control group; F18ab represents the IPEC-J2 after F18ab-stimulation; F18ac represents the IPEC-J2 after F18ac-stimulation. *. P<0.05圖1 F18大腸桿菌刺激小腸上皮細胞IPEC-J2后重要差異表達基因的qPCR驗證Fig.1 qPCR validation of important DEGs in IPEC-J2 cells after E.coli F18 stimulation

NC表示對照組；F18ab表示F18ab菌體刺激IPEC-J2；F18ac表示F18ac菌體刺激IPEC-J2NC represents the control group; F18ab represents the IPEC-J2 after F18ab-stimulation; F18ac represents the IPEC-J2 after F18ac-stimulation圖2 F18大腸桿菌刺激小腸上皮細胞IPEC-J2后重要差異表達基因的Western blot驗證Fig.2 Western blot validation of important DEGs in IPEC-J2 cells after E.coli F18 stimulation

SR表示蘇太豬F18抗性組；SS表示蘇太豬F18敏感組。*. P<0.05，**. P<0.01，下同SR represents the Sutai E. coli F18-resistant group; SS represents the Sutai E. coli F18-sensitive group; *. P<0.05; **. P<0.01, the same as below圖3 重要候選基因在蘇太豬F18抗性型與敏感型個體十二指腸組織中的差異表達分析Fig.3 Differential expression analysis of important candidate genes in duodenal tissues between Sutai E. coli F18-resistant and E. coli F18-sensitive individuals

MR表示梅山豬F18抗性組；MS表示梅山豬F18敏感組MR represents the Meishan E. coli F18-resistant group; MS represents the Meishan E. coli F18-sensitive group圖4 重要候選基因在梅山豬F18抗性型與敏感型個體十二指腸組織中的差異表達分析Fig.4 Differential expression analysis of important candidate genes in duodenal tissues between Meishan E. coli F18-resistant and E. coli F18-sensitive individuals

3 討 論

仔豬抵抗F18大腸桿菌感染，關鍵在于小腸上皮細胞F18大腸桿菌受體表達與否以及機體腸道免疫調控能力的差異[16]。Coddens等[24]通過對不同日齡的74頭長白豬進行檢測發現，隨著日齡的增加，E.coliF18受體的表達水平呈上升趨勢，尤其是在0～3周齡逐漸升高，而在3～23周齡維持平衡狀態。未斷奶的仔豬對大腸桿菌不敏感，不僅是因為大腸桿菌受體尚未形成，也由于母源抗體能夠保護仔豬免受致病菌感染[25]。因此，本研究選擇35日齡斷奶仔豬，這一時期無論表型還是自身的免疫機制，都表現出最易感染F18大腸桿菌。

基于課題組前期對梅山豬F18大腸桿菌抗性相關基因及其調控通路的研究[11]，本研究嚴格選擇蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型斷奶個體進行轉錄組測序，篩選出2個重要調控通路：Toll樣受體信號通路(KO. 04620)和鞘糖脂合成通路(KO. 00601)，以及重要差異表達基因(TLR5、IL-1β、FUT2)。TLR5、IL-1β均屬于Toll樣受體(TLR)家族基因，Toll樣受體(TLR)家族能夠識別保守的微生物結構(如細菌脂多糖)并激活信號通路，從而導致由微生物感染引起的免疫應答[26]。TLR能夠感應腸道中的微生物群體，并啟動促炎信號通路來抵抗微生物病原體的入侵，研究表明，TLRs在機體激活固有免疫和誘導適應性免疫的防御機制，特別是在先天性固有免疫中起著重要作用[27]。TLRs家族中，TLR5是機體識別革蘭氏陰性菌鞭毛蛋白的受體，鞭毛蛋白是革蘭氏菌鞭毛的主要成分，它可以直接被體內T細胞和B細胞識別，TLR5與鞭毛蛋白結合后，將進一步激活核轉錄因子NF-κB，而刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥細胞因子的產生，從而介導機體針對病原菌的先天性免疫及炎癥反應[28]。大腸桿菌F18受體最小抗原決定簇是ABH血型抗原中的1型H抗原[29-31]，由α-(1, 2)巖藻糖基轉移酶基因(FUT1、FUT2)催化的1型H-抗原被稱為組織血型抗原，它主要分布在分泌液，起源于組織的外胚層和中胚層中，而不是在紅細胞膜表面[31-33]?；谝陨涎芯繄蟮?，本研究發現，一方面通過F18大腸桿菌菌體刺激IPEC-J2細胞后，FUT2、TLR5、IL-1β的表達均顯著上調，另一方面對其在抗性型與敏感型個體腸道組織中表達水平進行檢測，發現FUT2在敏感組中極顯著高于抗性組(P<0.01)，而TLR5、IL-1β基因在抗性組中表達水平均顯著高于敏感組(P<0.05)，綜合兩者結果，在細胞水平和個體水平上驗證表明，TLR5、IL-1β、FUT2基因表達水平與F18大腸桿菌感染有關。

研究發現，Toll樣受體信號通路及其CD14基因在梅山斷奶仔豬抵抗F18大腸桿菌感染過程中起免疫調控作用[11]，本研究利用轉錄組測序結合功能驗證分析發現，Toll樣受體信號通路及其TLR5和IL-1β基因、鞘糖脂合成通路及其FUT2基因表達水平與蘇太豬F18大腸桿菌抗性有關。此外，研究發現，FUT1是控制F18菌毛與小腸黏膜受體結合的重要候選基因，成功運用于外來品種(如杜洛克豬)F18大腸桿菌的抗性育種[3-4]，并且FUT1屬于鞘糖脂合成通路基因。綜合以上研究表明，Toll樣受體信號通路(包括CD14、TLR5、IL-1β等基因)和鞘糖脂合成相關通路(包括FUT1、FUT2等基因)可能在斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性中均發揮重要的調控作用。然而，本研究發現，Toll樣受體信號通路和鞘糖脂合成通路在培育品種—蘇太豬(梅山豬×杜洛克)F18大腸桿菌抗性中均發揮重要調控作用，而梅山斷奶仔豬中僅僅發現Toll樣受體信號通路與F18大腸桿菌抗性有關[11]；在引進品種(如杜洛克豬)成功實現抗病育種的FUT1標記在幾十個國內地方豬品種(包括梅山豬)中呈現極端偏態分布[5-9]；本研究還發現，FUT2在蘇太豬抗性型與敏感型個體十二指腸組織中的表達水平存在顯著差異(P<0.05)，而F18大腸桿菌抗性型與敏感型梅山豬中FUT2表達水平差異不顯著(P>0.05)。結合課題組對中國地方豬品種(梅山豬)和培育品種(蘇太豬)F18大腸桿菌感染的分子調控機制分析以及相關報道綜合表明，引進與地方豬種F18大腸桿菌抗性的遺傳基礎確實存在差異，Toll樣受體信號通路及其CD14、TLR5基因在中國地方豬品種—梅山豬抵抗F18大腸桿菌感染過程中發揮重要的免疫調控作用，而鞘糖脂合成通路及FUT2基因在外來品種及蘇太豬(具有外來品種血統)調控F18大腸桿菌受體形成過程中發揮重要作用，但是該結論主要基于國內外前期關于外來品種F18大腸桿菌抗性的相關研究報道，下一步還需要在外來品種(如杜洛克豬)中利用前期梅山豬F18抗性相關通路和功能基因的驗證策略[11]來進一步的求證。

4 結 論

本研究利用比較轉錄組學分析了中外雜交培育品種—蘇太豬F18大腸桿菌抗性的分子調控機制，并從mRNA、蛋白質、個體和細胞水平上驗證發現，TLR5、IL-1β基因在梅山豬和蘇太豬抵抗F18大腸桿菌感染過程中發揮重要的免疫調控作用，而FUT2基因僅在蘇太豬(具有外來品種血統)調控F18大腸桿菌受體形成過程中發揮重要作用，由此推測，引進與地方豬品種F18大腸桿菌抗性的遺傳基礎存在差異，對于解釋引進與地方豬品種存在抗病力差異這一現象具有重要的科學意義。