鴨瘟病毒新近分離毒株部分基因變異分析

傅光華，陳翠騰，劉榮昌，盧立志，施少華，江 斌，傅秋玲，程龍飛，沈軍達，田 勇，萬春和，陳紅梅，黃 瑜*

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建省禽病防治重點實驗室，福州 350013； 2.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，杭州 310021)

鴨瘟病毒(duck plaque virus, DPV)是引起鴨、鵝和天鵝等雁形目鴨科水禽發生一種稱為鴨瘟的急性、敗血性、高度致死性傳染病病原[1-2]，又被稱為鴨腸炎病毒。DPV為皰疹病毒科α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬鴨甲皰疹病毒1型成員[2-3]，基因組為雙股線性DNA，不同毒株的基因組全長存在差異，在158～162 kb，包含長獨特區(UL)、內部反向重復序列(IRS)、短獨特區(US)及末端反向重復序列區(TRS)，包含約78個開放閱讀框(ORFs)[3-6]，即基因組結構為UL-IRS-US-TRS。

Baudet等于1923年首次報道鴨瘟在荷蘭發生。黃引賢[7]于1957年報道了我國廣州出現首例鴨瘟病例。DPV可感染不同品種及日齡的鴨，鴨瘟傳播迅速、流行廣泛，發病急、死亡率高，是危害養鴨業的主要疫病之一。近年來該病的流行出現了一些新的變化，如低日齡鴨發病增多，DPV對鴨的致病力減弱，免疫鴨群仍出現典型的鴨瘟[8-10]或非典型的鴨瘟病例等[11-13]。福建省曾于1998年出現櫻桃谷肉鴨感染鴨瘟的病例，此后至2015年的17年 間均未見發生鴨瘟的報道。然而2016年初開始，福建省部分地區肉鴨陸續出現疑似鴨瘟的病例[10]，2017年該病仍在鴨群中持續蔓延。本研究采集了2016—2017年福建不同地區37份臨床疑似感染DPV的病死鴨肝、食道組織，對樣品進行檢測、病毒分離以及部分基因的序列分析，以明確近年來在福建省鴨群中新流行的DPV分子特征，為新流行鴨瘟的快速確切診斷和防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源及處理

樣品為2016—2017年自福建不同地區送檢的疑似感染DPV病例樣品，共計37份。采集的樣品經磨碎后與含抗生素的0.01 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.2)按1∶3的比例制成懸浮液，將上述組織懸浮液凍融3次后，保存于-80 ℃備用。

1.2 臨床樣品的檢測及病毒分離鑒定

將處理好的臨床樣品離心后取上清，應用EasyPure Viral DNA/RNA Kit(北京全式金生物技術有限公司)提取病毒DNA。參照Plummer等[14]提供的方法進行DPV的PCR檢測。獲得的陽性樣品經尿囊腔接種10日齡非免疫鴨胚，棄24 h內死亡鴨胚，無菌收集24～120 h內死亡鴨胚和120 h仍未死亡鴨胚尿囊液，收獲的鴨胚尿囊液經PCR檢測為DPV陽性的分裝保存于-80 ℃備用。

1.3 DPV部分基因的PCR擴增

應用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取所有DPV陽性鴨胚尿囊液中的病毒DNA，應用高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技有限公司)擴增24株DPV分離株UL區域的UL56/LORF5(約4 kb)、TK/gH(約4 kb) 基因、UL2/UL1(約0.7 kb)，擴增引物見表1。反應液參照高保真酶使用說明配制，PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；隨后94 ℃ 30 s，50～58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；最后72 ℃延伸7 min結束反應，經1%瓊脂凝膠電泳為陽性的PCR產物純化回收后送福州鉑尚生物技術有限公司測序。

表1本試驗用擴增引物

Table1Thesequencesofprimerusedinthisstudy

引物名稱Primer name上游引物序列(5'→3')Up primer sequence下游引物序列(5'→3')Down primer sequence位置aLocationaUL56/LORF5GTCTACCTCCGACGACATGCAGATGTCTCATCAAGACCAACA2 419—4 602LORF5CGTATAGAGGACCACCATCACTAGTTTCTCGCGCCGCTGA4 425—6 311UL23(TK)CTGCTACGCGTCTACAAGGCGCTGAGATGTGGCGGTTCGA77 919—80 213UL22(gH)TAGCGCATACTCGTTCTCCAGGCAATGTGGACGTATATGA80 140—82 004UL2GAACGCTTCCTGAGCATGCACAGCATCCGTTATGCATTCGA115 105—115 889

a. 引物位置參考CV株(GenBank ID: JQ673560)基因組序列

a. Primers locations were according to the genome sequence of CV strain (GenBank ID: JQ673560)

1.4 序列分析

應用生物學軟件Lasergene 7.0 和MEGA 5.1 對測序結果進行拼接、編輯，并進行核苷酸變異及同源性分析；再運用MEGA5.1軟件中鄰接法Neighbor-Joining(Kimuar2-parameter算法)分析DPV分離株間的進化發育關系，構建病毒遺傳進化樹，利用自展法(Bootstrap Method)檢驗進化樹的可靠性，共進行1 000次重復分析。

2 結 果

2.1 DPV的分離與鑒定

參照Plummer等[14]提供的方法從37份臨床樣品中檢測到24份DPV陽性樣品，陽性率為65%，將24份陽性樣品接種10日齡非免疫鴨胚后，收集所有鴨胚尿囊液并進行PCR檢測。PCR擴增產物經1%瓊脂凝膠電泳顯示，24份尿囊液均擴增到目的條帶，回收純化擴增產物進行測序，表明所有擴增產物均為DPV基因片段。以上結果表明，24份陽性樣品均成功分離到DPV，其中2016年分離到14株，2017年分離到10株(表2)。從表2可發現，感染鴨的品種包括半番鴨、番鴨及麻鴨，感染鴨日齡從15至320 d均有。對感染鴨的日齡進行統計分析發現，半番鴨和番鴨感染DPV的日齡中位值(Me)分別為90和88 d，而麻鴨感染DPV的日齡中位值為287 d(圖1)。

表2臨床樣品分離的DPV毒株信息

Table2TheinformationofDPVstrainsisolatedfromclinicalsamples

毒株名稱Strain name宿主Host日齡/dAge采樣時間Collected time采樣地點RegionFujian-16-29半番鴨 Mule duck1672016福州Fujian-16-46半番鴨 Mule duck492016閩侯Fujian-16-47半番鴨 Mule duck452016閩侯Fujian-16-87半番鴨 Mule duck752016閩侯Fujian-16-145半番鴨 Mule duck1202016永泰Fujian-16-79番鴨 Muscovy duck152016莆田Fujian-16-140番鴨 Muscovy duck1202016閩侯Fujian-16-141番鴨 Muscovy duck1302016晉安Fujian-16-143番鴨 Muscovy duck1502016閩侯Fujian-16-36麻鴨 Sheldrake duck1852016福州

(轉下頁 Carried forward)

n. DPV病毒陽性樣本數；Me. 感染鴨日齡中位值n. Number of DPV-positive samples；Me. Medium value of DPV-positive-duck age圖1 感染DPV鴨日齡統計分析Fig. 1 Statistical analysis of the DPV-positive duck age

2.2 分離株UL56/LORF5測定分析

本研究對24株DPV分離株的UL56/LORF5區域進行擴增，獲得了2 432—6 262 bp間約3.83 kb的片段(GenBank ID為MH401564～MH401587)，所分離病毒間序列相似性在99.7%以上，與我國鴨群中分離的DPV強毒株CHv、LH2011、CV(又標記為CSC)及CV同源傳代毒株序列相似性極高，核苷酸相似性介于99.5%～99.8%，與疫苗株VAC或弱毒株(C-KCE和K)、其他地區的強毒分離株，如毒株2085(德國)、Holland(美國)的基因序列相似性在98.9%左右。值得注意的是毒株2085、Holland、Jansen和D11-JW-016(韓國)等4株病毒在基因組核苷酸2 561位后(核苷酸位置參照毒株CV基因組序列，下同)出現了1 167 bp的連續缺失，毒株Clone-03在2 703位核苷酸后出現了1 929 bp的連續缺失，疫苗株VAC或弱毒株(C-KCE和K)在2 715位后出現了3 513 bp核苷酸的連續缺失，本研究分離的24株病毒與我國的強毒株在該區域均未出現核苷酸的缺失或插入。

基于該擴增片段的分子系統進化分析表明，所有在該區域未出現基因缺失的毒株形成了2個不同進化分支(圖2)，其中強毒株CHv、LH2011、CV及其傳代毒株構成了進化分支Group Ⅰ，本研究分離的24株病毒構成了一個大的進化分支Group Ⅱ，這些分離株又形成2個不同的進化群，Fujian-16-01QL、Fujian-16-29、Fujian-17-38、Fujian-17-77和Fujian-17-78等5株病毒構成了Group Ⅱa進化分支，其余19株病毒形成Group Ⅱb進化分支(圖2)，各分離毒株20余位點存在核苷酸差異，其中10個 位點的核苷酸存在群特異性(表3)。

2.3 分離株TK/gH、UL2/UL1測定分析

2.3.1TK/gH基因 本研究擴增獲得了DPV 77 919—82 004 bp區域TK/gH基因約4.1 kb的片段(GenBank ID為MH401612～MH401635)，所有24株分離病毒與GenBank中登錄的DPV毒株該區域的核苷酸相似性在99.9%以上，未出現基因的缺失或插入，基于該基因區域的分子系統進化分析結果與基于UL56/LORF5區域的系統進化分析結果類似，所分離的24株病毒中，Fujian-16-01QL等5株病毒構成一個進化分支，其余的19株病毒構成另外一個進化分支(圖3)。24株分離毒株與GenBank已登錄的病毒株該區域的序列高度保守，但不同毒株在78 577、78 866及79 333 bp 3個位點的核苷酸存在差異，這3個位點均處于TK基因中。毒株FJ-16-01QL、FJ-16-29、FJ-17-77和FJ-17-78在78 577位的核苷酸為胞嘧啶(C)，其余20株病毒及GenBank已登錄的毒株均為胸腺嘧啶(T)；毒株FJ-16-36、FJ-16-46、FJ-16-47、FJ-16-98、FJ-16-128A、FJ-16-140、FJ-16-141、FJ-16-145、FJ-17-18、FJ-17-43和FJ-17-82等11株病毒在78 866位 的核苷酸為胸腺嘧啶(T)，其余13株病毒及GenBank已登錄的毒株均為胞嘧啶(C)；Fujian-16-01QL、Fujian-16-29、Fujian-17-38、Fujian-17-77和Fujian-17-78等5株 病毒在79 333位的核苷酸為腺嘌呤(A)，其余19株病毒及GenBank已登錄的毒株均為胞嘧啶(C)。

標注黑三角(▲)的毒株為本研究分離毒株；圖中樹結處的阿拉伯數字為Bootstrap檢驗置信值(1 000次重復)，低于75的置信值未顯示Virus marked with black triangle (▲) were isolated in this study; Arabia numbers on the tree node represented confidence values from bootstrap test (1 000 replicates), confidence values less than 75 were not shown圖2 基于UL56/LORF5基因的DPV分子系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of DPV based on UL56/LORF5 gene

2.3.2UL2/UL1基因 本研究擴增獲得了DPV 115 106—115 889 bp區域UL2/UL1基因約0.78 kb的片段(GenBank ID為MH401588～MH401611)，所有24株分離病毒該區域的序列高度保守，與GenBank中登錄的DPV強毒株CV、CHv、2085及2016年廣西分離株Yulin/2016/30D(KX925439.1)和Yulin/2016/60D(KX925440.1)的核苷酸相似性均在99.9%以上，而疫苗株VAC或致弱毒株C-KCE和K從115 223 位后開始出現524 bp的連續缺失，另外與其他毒株相比，疫苗株VAC在115 160、115 165及115 208位后均有一個腺嘌呤堿基(A)插入。

表3分離株不同進化分支間的差異核苷酸

Table3Differentialnucleotidesamongdifferentvirallineages

病毒進化群Virus lineage差異核苷酸位置Location of differential nucleotide2 615*3 3493 3703 5254 2014 2364 2984 4314 7455 464Group ⅠT-CTGAAGACGroup ⅡaA-CGATGGATGroup ⅡbTATGAAGTGC

*. 核苷酸位置參考強毒株CV株(GenBank ID：JQ673560)基因組序列

*. Nucleotide locations were according to the reference virulent virus genome sequence of CV strain (GenBank ID: JQ673560)

3 討 論

標注黑三角(▲)的毒株為本研究分離毒株Viruses marked with black triangle (▲) were isolated in this study圖3 基于TK/gH基因的DPV分子系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of DPV based on the TK gene and gH gene

鴨瘟自1957年在我國被發現以來已有60多年，盡管各地陸續出現報道，但各分離毒株的抗原性高度保守，疫苗的使用對該病的控制取得了顯著效果[2]。然而，近年來，臨床上病例報道日漸增多，部分免疫過鴨瘟疫苗的鴨群依然發生該病[9-11]，鴨瘟的地方性流行已不容忽視。本研究對2016—2017年福建省鴨群中流行的鴨瘟病毒流行狀況調查發現，低日齡鴨發生鴨瘟的病例日漸增多，且易感日齡存在品種差異。流行病學統計發現，確診的24個病例為肉用番鴨、半番鴨及麻鴨；半番鴨和番鴨感染DPV的日齡中位值(Me)分別為90和88 d，而麻鴨感染DPV的日齡中位值為287 d(圖1)，即半番鴨及番鴨多在青年期較易感染DPV，而麻鴨則在產蛋高峰期更易感染該病毒。鑒于這種品種間的易感日齡差異，建議對以上不同鴨品種制定針對性鴨瘟疫苗免疫程序，以免因免疫程序不當造成的免疫失敗。對于24個發病鴨群，經調查其中17個鴨群分別于發病前不同時間免疫過不同羽份量的鴨瘟弱毒疫苗，但依然發病，且病死率很高，這可能與疫苗運輸和保存不當、疫苗質量不穩定等有關，為此建議鴨瘟疫苗生產企業、經銷單位予以重視。至于新流行鴨瘟病毒是否發生抗原性變異，尚需進一步研究明確。

據DPV基因組5′末端UL區域(UL56/LORF5)基因缺失情況，可將現有的DPV大致分為四類，一類是以我國參考毒株CV株(又稱為CSC株)及CHv株為代表的強毒株，其基因組最長，在162 kb以上[5-6,15-17]；第二類是以德國毒株2085為代表的強毒株，其基因組在2 561位(參照毒株CV基因組序列，下同)后出現了1 171 bp的連續缺失[15,18]，另外登錄在GenBank數據庫中的美國Holland分離株、法國Jansen分離株及韓國D11-JW-016分離株均在該區域出現相同片段缺失；第三類是以Clone-03為代表的毒株，其基因組在2 703位 核苷酸后出現了1 930 bp的連續缺失[19-20]；第四類是以疫苗株VAC為代表，這類病毒基因組全長158 kb左右，在基因組2 715位后出現了3 513 bp核苷酸的連續缺失[4,15]，弱毒株C-KCE和K也在該區域出現相同的基因缺失[21-22]。本研究所分離的24株毒株在基因組變異較大的5′末端UL區域(UL56/LORF5)均未出現基因連續缺失。盡管所分離的24株病毒之間及與我國強毒參考株CV及CHv等毒株間同源性極高，但前者與后者在5′末端UL區域(UL56/LORF5)存在30多個核苷酸差異。系統進化分析表明，所有已報道的在該區域未出現連續缺失的毒株演化成了2個不同進化分支(圖2)，本研究分離的24株病毒構成了一個新的進化分支(Group Ⅱ)，且這些分離株存在不同程度的差異，在Group Ⅰ、Group Ⅱa和Group Ⅱb 3個群之間存在10個進化分支特異性的差異性核苷酸位點(表3)?？梢?，當前在鴨群中流行的DPV出現了不同程度的、有規律的變異，毒株在流行過程中形成了不同的進化亞分支。目前還不清楚這些變異是否會改變病毒的抗原性，是否與毒株持續在鴨群、甚至在免疫鴨群中流行相關。

本研究對24株病毒的TK基因及gH基因分析表明，盡管該區域與GenBank中登錄的DPV毒株有極高的序列同源性，但在TK基因中還是存在3位點的差異，且其中2個位點(78 577 bp及79 333 bp)變異的毒株均為上述Group Ⅱa進化分支中的毒株。根據DPV基因組3′末端UL區域可將現有的DPV大致可分為兩群病毒，一群是以CV、CHv及2085等強毒株為代表的毒株，在3′末端UL區域(UL2基因)未出現基因的缺失[6,17,19]，另一群是疫苗株VAC或致弱毒株C-KCE和K等毒株，其基因組在115 223位(參照毒株CV基因組序列)后開始出現524 bp的連續缺失[4,15, 21-22]。本研究所分離的24株DPV與我國DPV參考強毒CV、CHv及其他流行毒株在該區域的序列相似性達到100%，未出現連續的基因缺失。以上結果表明，所分離的24株病毒TK、gH及UL2基因區域在傳播流行過程中高度保守。

4 結 論

對2016—2017年福建省鴨群中發生的鴨瘟流行狀況及其病毒的分子特征進行了分析，發現鴨感染DPV存在品種間的易感日齡差異，當前新流行的DPV與我國參考強毒株的分子特征相近，但在部分基因上已出現不同程度的變異，應加強對新流行DPV的分子流行病學監測，以實時了解其變異情況。