北京地區豬圓環病毒3型感染的檢測及基因組遺傳變異分析

孫 明，馬 君，喬明明，劉巧榮，田新生，楊欣艷，孫勝永，陳西釗,2*

(1. 北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京 100094； 2. 中國動物疫病預防控制中心，北京 100125)

豬圓環病毒(porcine circovirus, PCV)屬于圓環病毒科(Circoviridae)，圓環病毒屬(Circovirus)，為無囊膜的單股負鏈環狀DNA病毒，是在哺乳動物細胞中能自主復制的最小病毒。豬圓環病毒目前有兩個血清型：豬圓環病毒Ⅰ型(PCV1)和豬圓環病毒Ⅱ型(PCV2)[1]。PCV1對豬沒有致病性，PCV2可致豬圓環病毒病(porcine circovirus associated disease, PCV AD)，包括斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、繁殖障礙(reproductive failure)等有關，給養豬業造成了巨大的經濟損失[2-3]。本研究從患PMWS的斷奶仔豬體內檢出圓環病毒3型的序列，并對其病毒分離和全基因測序，分析其培養特征和基因組的遺傳變異情況，為PCV3在中國的流行病學調查以及有效防治提供科學的依據。PCV2最早在1985年被發現可導致多系統疾病，但屬于零星發生，直至20世紀90年末才成為流行趨勢，并遍布世界很多國家。我國于2001年首次報道該病[4]，目前已廣泛流行，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。有人報道在豬、牛胃蛋白酶和嚙齒類動物中檢出PCV1和PCV2的DNA，這使得PCV2再次受到眾多研究人員的關注。2016年Palinski等[3]和Phan等[5]首次報道了一種新的圓環病毒——PCV3。Palinski等[3]用PCR和IHC方法，從PDNS損傷的母豬皮膚、肺、腎、淋巴結、血清以及流產胎兒體內檢出PCV3，推測PCV3可垂直傳播。PCV3的Cap蛋白和Rep蛋白氨基酸序列與PCV2和蝙蝠圓環病毒相似性分別是37%和55%。Li等[6]報道，環形病毒和圓環病毒可能存在跨物種傳播。翟少倫等[7]對豬圓環病毒感染人類的可能途徑進行了剖析，不過這些推測需要進一步的試驗驗證和臨床調查。我們針對這個新出現的病毒——PCV3從分子方面進行相關研究，分析其遺傳變異特征，以研究PCV3與PCV2、PCV1以及其他物種的圓環病毒之間的親緣關系，為PCV3的流行病學和防控研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 患豬臨床情況

收集2016年12月至2017年11月期間，北京地區規模化養豬場73份臨床表現繁殖障礙和嚴重呼吸道疾病豬的淋巴結、肺、脾和腎等組織，-70 ℃保存備用。

1.2 載體、菌株和主要試劑

pMD19-T克隆載體、Ex-Taq酶購自大連TaKaRa公司；DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；總DNA提取試劑盒為北京世紀元亨動物防疫技術有限公司產品，膠回收試劑盒為Omega產品。豬圓環病毒3型實時熒光PCR檢測試劑盒、豬圓環病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。

1.3 引物的設計與合成

根據GenBank上發表的PCV3和PCV2全基因序列分析，設計3對引物，由上海英駿生物技術有限公司合成，見表1。

表1引物序列

Table1Thesequenceoftheprimers

引物名稱Primer name上游引物(5'→3')Sense primer下游引物(5'→3')Antisense primer產物位置Genome positionP1TAGTATTACCCGGCACCTCGGAAATTCATCAAATGGAACCCACCCAT1—880位P2TTGGTGGGATGGTTATA ATGGGGAGCCTCTTCTTTTTCTCCAGACCCA806—1 505位P3TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCAGTGCCCGGCACCAAAATGAGACACA1 381—2 000位

1.4 基因擴增

用DNA提取一份陽性病料，按照DNA試劑盒說明書提取病毒全基因組，按照以下程序進行基因擴增：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環后，72 ℃延伸10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用OMEGA公司膠回收試劑盒回收純化擴增的目的基因片段。

1.5 擴增產物的克隆及測序

分別將PCR擴增得到的3個片段連接到pMD19-T中，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞。用PCR方法篩選陽性克隆，將初步鑒定的陽性克隆送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.6 PCV3全基因組拼接以及序列同源性分析

應用DNAMan和DNAStar對測序序列進行拼接，并將其與PCV1、PCV2、PCV3以及其他物種圓環病毒基因組序列進行序列同源性分析、比對；并對其Rep蛋白和Cap蛋白氨基酸序列進行比對分析，繪制系統進化樹。

2 結 果

2.1 2016—2017年北京地區PCV3檢出情況

用豬圓環病毒3型和豬圓環病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒進行檢測，檢測結果顯示PCV2和PCV3陽性率分別為58.9%(43/73)和30.1%(22/73)，PCV3和PCV2混合感染率24.7%(18/73)。

2.2 PCV3基因組擴增

成功獲得與預期大小相符的基因片段，結果見圖1。大小分別為880、700和620 bp。

1、2和3分別代表P1、P2和P3引物擴增；M.DL2000 DNA相對分子質量標準1, 2, and 3 were amplified with P1, P2, and P3 primers, respectively；M. DL2000 DNA marker圖1 PCV3全基因組克隆Fig.1 Clones of PCV3 genome

2.3 克隆鑒定和測序

重組質粒經PCR鑒定顯示，成功將3個片段克隆到pMD19-T載體中。陽性質粒經測序、拼接，獲得了PCV3全基因組序列，序列全長2 000 nt。該序列已經提交到GenBank上，登錄號為MG546667，將該病毒命名為PCV3/CN/BJ-YH2016。基因組含有3個開放閱讀框(ORF)，主要編碼2種蛋白：復制相關蛋白(Rep)和核衣殼蛋白(Cap)。

2.4 基因組序列同源性分析

利用DNAMAN生物分析軟件將PCV3/CN/BJ-YH2016基因組序列與NCBI上現有的PCV3全基因組序列進行比較分析，并繪制系統進化樹(圖2)。發現基因組序列與NCBI上的30株PCV3序列相似性為98.6%～99.3%。其中與PCV3/CN/Anhui-14/201611毒株相似性最低，和PCV3-US/SD2016毒株(KX966193)、PCV3/CN/Chongqing-148/2016(KY075991)、PCV3/CN/Chongqing-147/2016(KY075990)和PCV3/CN/Jiangxi-62/2016(KY075989)相似性最高。

與PCV2、PCV1以及其他物種的圓環病毒基因組序列系統進化分析顯示，PCV3可能與水貂圓環病毒和蝙蝠圓環病毒親緣關系密切，在一個大的分枝上，見圖2。

圖2 PCV3/CN/BJ-YH2016毒株與其他參考毒株全基因組進化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the complete genomes of PCV3/CN/BJ-YH2016 and other reference viruses

2.5 Rep遺傳進化分析

分析現有的PCV3毒株，本分離株與美國毒株PCV3-US/MO2015(GenBank序列號KX778720)毒株的Rep蛋白氨基酸序列相似性最高(為100%)，與國內毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016(GenBank序列號MF589105)相似性最低(為95%)，有16個氨基酸變異，全部集中在5—23位氨基酸，與PCV3-US/MN2016、PCV3-US/SD2016和2164毒株的Rep基因推導氨基酸序列對比有3個氨基酸變異，分別位于44、122和187 aa位點。與PCV2、PCV1和BatCV相比，Rep氨基酸序列相似性分別為48%、46%和55%。Rep系統進化樹顯示，該分離株和蝙蝠以及魚類圓環病毒在一個分枝上，親緣關系較近(圖3)。

2.6 Cap遺傳進化分析

Cap蛋白氨基酸序列與美國毒株2164(KX458235)的相似性為100%，與其他毒株均有1～4個氨基酸發生變異，其中與PCV3-US/MO2015毒株相比，變異位點分別位于24、26、56和100 aa。該毒株Cap基因核苷酸序列與國內26個毒株以及國外7個代表毒株的Cap基因相比，核苷酸相似性分別為97.2%～100%和97.6%～100%，編碼的氨基酸序列相似性分別為97.8%～100%和98.1%～100%；表明PCV3北京毒株和國內外PCV3具有較高的同源性，遺傳關系較近。系統進化樹顯示該分離毒株屬于3b亞群(圖4)。

圖3 基于PCV3 Rep基因序列同源性的遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PCV3 on Rep gene sequence homology

圖4 基于PCV3 Cap基因序列同源性構建的遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PCV3 on Cap gene sequence homology

3 討 論

PCV1普遍存在于豬群中而不致病，PCV2通常被認為是引起豬圓環病毒病的主要因素。Li等[6]報道在腹瀉患者和健康人的糞便、人用疫苗及牛肉中檢測到PCV2；稱PCV2可能感染人類的路線包括食物傳播(使用或者接觸新鮮豬肉產品，食用未熟牛肉或者生鮮奶、喝生水)、接種感染、異種器官移植、空氣傳播，以突出公共衛生意義和物種交叉傳播[8]。20世紀90年代中期，PCV2首次從加拿大斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)的患病豬體內分離[9]，很快遍布世界各地。1993年PDNS在世界多個國家報道，并陸續在豬體內檢測到PCV2，并認為PCV2是主要致病因素。后Thibault等[11]和Segalés等[12]報道從豬體內檢測到的PCV2抗原不一致，這引發了人們對PCV2在PDNS中作用的猜測[3]。2016年，美國學者報道了一種新的圓環病毒基因型——PCV3，該病毒從出現PDNS癥狀、流產仔豬以及患PMWS的斷奶仔豬體內分離得到，而PCV2檢測為陰性[3, 5]。這提示PCV3可能為導致PDNS、PMWS以及繁殖障礙的病原之一。

由于PCV2對養豬業造成了很大的經濟損失，故應對這個新出現的PCV3進行更深入的研究，以證明其在PCVADS中的重要性。Phan等[5]從3例出現厭食、體重下降、關節和淋巴結腫大，心損傷和多系統炎癥(腸炎、肺炎)等癥狀的斷奶仔豬體內檢測出PCV3。Palinski等[3]從患PDNS的母豬流產木乃伊胎和死于PDNS的母豬體內檢測到PCV3，他們用PCR和IHC方法，從患PDNS樣損傷的母豬的皮膚、肺、腎和淋巴結中檢出PCV3，而未檢測到PCV2，他們對271份豬呼吸系統疾病豬進行了qPCR和ELISA檢測，分別檢出陽性34份(12.5%) 和83份(55%)，表明PCV3是侵蝕呼吸系統的。2016年12月至2017年11月，本實驗室對北京地區規模化養豬場臨床表現繁殖障礙和嚴重呼吸系統疾病的患豬進行了PCV2和PCV3的檢測，結果顯示，PCV2和PCV3陽性率分別為58.9%(43/73)和30.1%(22/73)，PCV3和PCV2混合感染率24.6%(18/73)，此數據與Ku等[10]的研究結果相一致。本研究充分證明，北京也存在PCV3的感染。隨之對養殖場進行調研，結果發現，大部分養殖場管理不當，疫苗免疫不規范，未定期對豬進行PCV2免疫，衛生情況欠佳，發病豬主要集中在20～30日齡的保育豬，保育豬出現呼吸道癥狀，腿關節腫大，死亡率高達30%，母豬流產，產木乃伊胎。這些結果說明PCV3在不孕、PDNS和PMWS中扮演著重要的角色。為了進一步研究PCV3遺傳變異特征，本研究選取1份PCV3陽性樣品進行全基因組測序。

測序結果和遺傳進化分析顯示，該病毒基因組全長2 000 bp，并將病毒命名為PCV3/CN/BJ-YH2016。其與NCBI上的30株PCV3基因組序列相似性為98.6%～99.3%；基因組序列系統進化分析顯示，PCV3與PCV2、PCV1以及水貂圓環病毒和蝙蝠圓環病毒在一個大的分枝上，親緣關系密切。Rep蛋白氨基酸序列分析顯示，該毒株與美國毒株PCV3-US/MO2015毒株的相似性最高，為100%；與國內毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016相似性最低，為95%；PCV3與PCV2、PCV1和BatCV相比，相似性分別為48%、46%和55%；系統進化樹顯示，該分離株和犬圓環病毒、鵝圓環病毒、鴨圓環病毒以及蝙蝠圓環病毒在一個分枝上，親緣關系較近。這與Palinski等[3]和Phan等[5]的研究結果相一致。Phan等[5]認為：無論PCV3在豬體內一直存在還是從別的物種傳播引起，仍是未知數，這需要對歷史樣品進行研究分析。Palinski等[3]根據PCV3、PCV2、PCV1和其他物種的圓環病毒系統進化樹提出：PCV3、PCV2、PCV1和BatCV-2(蝙蝠圓環病毒)可能擁有共同的祖先，然而這種推測缺少有力證據[3,13]。

Cap基因序列比對結果顯示，北京毒株PCV3/CN/BJ-YH2016與國內26個毒株以及國外7個代表毒株的Cap基因相比，核苷酸相似性分別為97.2%～100%和97.6%～100%，編碼的氨基酸序列相似性分別為97.8%～100%和98.1%～100%；表明PCV3北京毒株和國內外PCV3具有較高的同源性，遺傳關系較近；系統進化樹顯示目前國內外毒株主要是3a和3b亞型，本分離毒株屬于3b亞群。

本研究表明PCV3在北京地區廣泛存在，且患病豬場一般存在管理不當，疫苗免疫不規范，衛生情況欠佳，且出現24.6%患豬同時感染PCV2和PCV3，并伴有細菌感染。有報道PCV3和PCV2毒株的抗原交叉保護性較低，現有的PCV2疫苗無法為PCV3感染提供有效的免疫保護作用[2，14-15]。養殖場之所以出現30%的死亡率，可能與患豬感染PCV2、PCV3并伴有細菌感染有關，從而導致發病豬較高的死亡率。因此，養殖場應加強衛生管理、按時接種疫苗，并定期進行PCV3的流行狀況調查，以有效防控PCV3的流行。

4 結 論

北京地區豬群中已存在PCV3感染，并對其進行了基因組測序，基因組遺傳分析結果顯示，PCV3全基因組長2 000 bp，并命名為PCV3/CN/BJ-YH2016。其Rep蛋白氨基酸序列與美國毒株PCV3-US/MO2015的相似性最高，為100%；與中國毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016相似性最低，為95%；Cap蛋白氨基酸序列與美國毒株2164的相似性為100%，與其他毒株相比均有4個氨基酸發生變異。這些數據將為研究這種新型病毒——PCV3的遺傳變異和流行病學特征提供分子生物學依據。