雌二醇對雌性家兔十二指腸肌電活動的作用研究

杜宜楠，郭雅茹，趙建帥，張 金，辛先萌，馬藝嘉，何雪旻，徐永平

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

雌激素(estrogen)是雌性動物體內具有廣泛生物學活性的一類甾體激素，不僅參與生殖活動調控，對消化、呼吸、心血管等非生殖系統的功能也有重要的影響[1-3]。諸多臨床資料表明女性在月經前期以及月經期會出現腹脹、便秘[4]等胃腸動力障礙或腹痛、腹泄[5]等胃腸動力亢進。Cokun等[6]給予雄性大鼠長期的雌激素處理后觀察到其胃排空活動會被顯著抑制，但Ryan等[7]給予卵巢摘除雌性大鼠雌二醇處理后發現其胃排空和結腸轉運速度顯著加快。Pines等[8]、王新均等[9]采用雌二醇分別處理大鼠的回腸以及家兔的十二指腸，均觀察到雌二醇會呈濃度依賴性地顯著抑制腸道的收縮活動，然而馮梅等[10]同時給予大鼠結腸雌激素和催產素處理后發現其收縮活動顯著增強，且增強效應與雌激素濃度呈正相關。上述研究結果表明雌激素調節胃腸運動的生物學效應并不一致，提示雌激素與胃腸動力的效應關系可能與其濃度依賴性有關，并涉及神經與內分泌復雜的協同調控機制。

隨著網絡通訊、儲存及云計算等IT技術的發展與廣泛應用，基于生物學研究數據的數模構建對生物學規律的定量化、準確化揭示具有十分重要的意義[11-12]。通過研究雌激素對胃腸運動調節的作用方式并構建相關的數學模型，不僅可以進一步豐富雌激素的生物學作用，而且能運用數學語言描述雌激素與胃腸運動的效應關系，更好地服務于臨床和生產上雌激素類藥物的研發和使用。因此本試驗采用BL-420F生物機能試驗系統，系統地研究不同濃度苯甲酸雌二醇與卵巢摘除模型家兔體內十二指腸肌電活動的效應關系，并運用采集的相關指標的數據構建數學模型，擬為闡明體內雌激素調節十二指腸動力的作用機制以及雌激素類藥物的研發和應用提供一定的理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物選取健康的4月齡雌性新西蘭家兔25 只，平均體重(2.0±0.3) kg(均購自陜西省咸陽市武功縣玉兔養殖場)，于干凈、衛生環境中，在符合動物福利的相關要求下適應性飼養一周后用于試驗。

1.1.2 試驗材料 陸眠寧Ⅱ，購自吉林省華牧動物保健品有限公司；苯甲酸雌二醇注射液，規格為2 mL∶3 mg，購自哈爾濱中大獸藥有限責任公司；BL-420F生物機能實驗系統，購自成都泰盟科技有限公司；注射用青霉素鉀，規格為80萬單位·瓶-1，購自山西振東泰盛制藥有限公司。

1.2 動物模型的構建

1.2.1 卵巢摘除動物模型構建 試驗家兔術前禁食12 h，自由飲水。麻醉保定后，于家兔腹正中線骨盆前 3～4 cm處切口，打開腹腔，暴露卵巢，結扎血管后，摘除卵巢。復位內臟，逐層縫合腹膜、肌肉和皮膚，術畢消毒護理。術后將實驗動物置于衛生、安靜的環境中，并肌內注射80萬單位青霉素，連續3 d，同時注意護理，至家兔恢復到術后14 d時進行電極埋置動物模型構建。

1.2.2 電極埋置動物模型構建 試驗家兔術前禁食12 h，自由飲水。麻醉保定后，于腹前部劍狀軟骨后緣偏右部切口，打開腹腔，暴露十二指腸前部。在十二指腸距離幽門5 cm處，沿腸壁肌層縱向平行埋植一對導線并固定。復位內臟，逐層縫合腹膜、肌肉和皮膚，術畢消毒護理。術后將其置于衛生、安靜的環境中，并肌內注射 80萬單位青霉素，連續 3 d，同時注意護理，至家兔恢復到術后14 d時進行藥物處理及肌電監測。

1.3 苯甲酸雌二醇對卵巢摘除家兔十二指腸肌電活動的影響

將25 只試驗家兔按“1.2”的方法先后構建卵巢摘除和電極埋置動物模型后，隨機分為A～E共5組，每組5只。其中A組連續3 d每日肌內注射一次生理鹽水，B、C、D、E組按照0.05、0.10、0.15和0.20 mg·kg-1的劑量分別每日肌內注射一次苯甲酸雌二醇，連續3 d。在最后一次注射后，禁食禁水12 h，準備開始測量。測量時，將兩導線接入BL-420F生物機能實驗系統的生物電信號換能器，并于生物機能實驗系統的輸出端將監測的參數設置如下：增益，1 mV；時間常數，1 s，濾波，10 Hz；掃描速度，2.5 s·div-1，于背部皮膚接好參考電極后，監測肌電活動，待波形穩定后進行記錄，連續記錄至少60 min。將得到的結果以10 min作為一個時間段，分別采集振幅(單位：mV)和頻率(單位：min-1)兩個數據信息，并將單位時間內平均振幅與頻率相乘，換算為十二指腸肌電活動指數(單位：mV·min-1)。每只家兔的連續波形圖均隨機采集3～4個數據樣本，采用SPSS 18.0 軟件分別對平均振幅、頻率和十二指腸肌電活動指數進行統計，配對樣本t檢驗進行組間差異性分析，結果均以“平均數±均方差”來表示。

1.4 苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電活動影響的數學模型構建

基于“1.3”中的統計分析結果，根據組間是否有顯著性差異，分析所得數據適合構建的數學模型類型。采用Origin 8.0 軟件，以苯甲酸雌二醇劑量為橫坐標，振幅、頻率以及肌電活動指數為縱坐標，分別繪制苯甲酸雌二醇劑量與上述監測指標關系的二維散點圖，并分析其可能的函數特征，篩選近似函數類型。以該函數模型為模板，分別以振幅、頻率以及肌電活動指數作為因變量，苯甲酸雌二醇劑量作為自變量進行函數擬合精度分析，根據王婷等[13]、張銳等[14]、Marín等[15]的方法，選擇同等條件下決定系數(R2)最大同時P值最小的一項函數作為反映雌二醇劑量與胃腸肌電活動關系的最優函數模型，并依據該函數特征，對苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電活動的影響進行分析。

2 結 果

2.1 卵巢摘除后不同劑量的苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電活動的影響

不同劑量苯甲酸雌二醇對卵巢摘除家兔十二指腸肌電影響如圖1、表1所示。

對各試驗組連續電波的振幅統計結果分析發現，相鄰組間的振幅均有極顯著差異(P<0.01)。當注射劑量為0.05、0.10 mg·kg-1時，振幅隨雌二醇劑量的上升而上升，在0.10 mg·kg-1時達到最大值；注射劑量為0.15、0.20 mg·kg-1時，振幅隨雌二醇劑量的上升而下降，在0.20 mg·kg-1時達到最小值。

對各試驗組連續電波的頻率統計結果分析發現，除A組(生理鹽水)與B組(0.05 mg·kg-1雌二醇)無顯著性差異(P>0.05)之外，其余相鄰試驗組組間的頻率均有極顯著差異(P<0.01)。當注射劑量為0.05、0.10 mg·kg-1時，頻率隨雌二醇劑量的上升而上升，在0.10 mg·kg-1時達到最大值；注射劑量為0.15、0.20 mg·kg-1時，頻率隨雌二醇劑量的上升而下降，在0.20 mg·kg-1時達到最小值。

對各試驗組的肌電活動指數統計結果分析發現，相鄰組間的肌電活動指數均有極顯著差異(P<0.01)。當注射劑量為0.05、0.10 mg·kg-1時，肌電活動指數隨雌二醇劑量的上升而上升，在0.10 mg·kg-1時達到最大值；注射劑量為0.15、0.20 mg·kg-1時，肌電活動指數隨雌二醇劑量的上升而下降，在0.20 mg·kg-1時達到最小值。

由上述結果可知，各試驗組連續電波的振幅、頻率以及肌電活動指數均隨著苯甲酸雌二醇的劑量呈現出先升高后下降的趨勢，表明雌激素對十二指腸肌電活動呈現濃度依賴性雙重調節作用。

2.2 苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電影響的數學模型構建

觀察分析以苯甲酸雌二醇劑量為橫坐標，振幅、頻率和肌電活動指數分別為縱坐標繪制的二維散點圖(圖2)，均具有類似于高斯函數的圖像分布特征，故對振幅、頻率和肌電活動指數進行以高斯函數y=y0+A× exp{-0.5 × [(x-xc)/W]2}為模板的擬合精度分析。結果表明(表2)，以肌電活動指數為因變量構建函數模型的R2=0.995 2且P=0.002 0，為選出的最優模型，其表達式為：

A～E: 0、0.05、0.10、0.15、0.20 mg·kg-1雌二醇組A-E: 0、0.05、0.10、0.15、0.20 mg·kg-1 estradiol group圖1 不同試驗組家兔十二指腸肌電連續波形示意Fig.1 Sketch map of the continuous waveform of duodenal myoelectricity in rabbits of different experimental groups

表1苯甲酸雌二醇對卵巢摘除家兔十二指腸肌電活動頻率、振幅以及肌電活動指數的影響(平均數±均方差)

Table1Statisticalresultofeffectofestradiolbenzoateonthefrequency,amplitudeandmyoelectricactivityindexintheduodenumofovariectomizedrabbits(Mean±Meansquaredeviation)

試驗分組Test group雌二醇劑量/(mg·kg-1) Dosage of estradiol樣本數Sample number頻率/(min-1)Frequency振幅/mVAmplitude肌電活動指數/(mV·min-1)Myoelectric activity indexA0(生理鹽水,normal saline)1620.87±1.32B0.091±0.034C1.60±0.18CB0.051821.52±1.78B0.135±0.071B2.95±0.51BC0.101724.07±2.09A0.207±0.112A5.22±0.86AD0.151621.62±1.36B0.126±0.060B2.78±0.51BE0.201917.89±2.49C0.092±0.044C1.51±0.25C

同列數據后標有相同字母表示組間無顯著差異(P>0.05)；不同字母表示組間差異極顯著(P<0.01)

The same letters signed in the data of the same column means there were no significant between treatments (P>0.05); The different letters mean there were very significant between treatments (P<0.01)

y= 1.50+3.73 × exp{ -0.5 × [(x-0.098)/ 0.035 ]2}。

在該表達式中，y0為1.50 mV·min-1，代表肌電活動指數變化最低臨界值，即雌二醇對十二指腸肌電活動指數作用的最低值不會低于1.50 mV·min-1；A為3.73 mV·min-1，代表十二指腸肌電活動指數變化量的峰值，即雌二醇對十二指腸肌電活動指數的最大變化量為3.73 mV·min-1；y0與A共同反映了肌電活動指數的范圍，即1.50(y0)～5.23(y0+A) mV·min-1，這一結果說明雌激素對十二指腸肌電活動的調節作用是在十二指腸本身具備一定水平的肌電活動的基礎上進行的，也就是說雌激素只是作為一個間接調控者在有限范圍內發揮其調節作用，而并不是其直接調控者。xc為0.098 mg·kg-1，代表雌二醇產生對肌電活動指數最大作用時所對應的劑量，即在雌二醇劑量為0.098 mg·kg-1時肌電活動指數取到最大值5.23 mV·min-1；W為0.035 mg·kg-1，代表擬合函數的均方差；xc與W共同反映了十二指腸肌電活動指數變化趨勢的特征，即分別以0.063(xc-W)、0.098(xc)、0.133 (xc+W)mg·kg-1，三個劑量為拐點，將雌二醇對十二指腸肌電活動指數作用的變化趨勢分為以下4段：雌二醇劑量范圍為0～0.063 mg·kg-1時，肌電活動指數隨雌二醇劑量的增加而呈指數型模式增加；劑量范圍為0.063～0.098 mg·kg-1時，肌電活動指數隨雌二醇劑量的增加而呈對數型模式增加；劑量范圍為0.098～0.133 mg·kg-1時，肌電活動指數隨雌二醇劑量的增加而呈指數型模式減小；劑量超過0.133 mg·kg-1后，肌電活動指數隨雌激素劑量的增加而呈對數型模式減小(圖3)，這進一步說明雌二醇對十二指腸肌電活動是一種濃度依賴性雙重調節作用，并且這種作用在不同的濃度范圍內表現不同的變化趨勢，呈現明顯的區間效應。

圖2 苯甲酸雌二醇劑量與振幅、頻率和肌電活動指數關系的散點圖Fig.2 Scatter diagram of relationship between dose of estradiol benzoate and amplitude, frequency and myoelectric activity index

圖3 苯甲酸雌二醇劑量與十二指腸肌電活動指數函數示意圖Fig.3 Sketch map of function of dose of estradiol benzoate and myoelectric activity index

3 討 論

3.1 苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電活動的影響

雌激素是一類主要由雌性動物卵巢和胎盤產生并分泌的類固醇激素，以雌二醇、雌三醇和雌酮為主，參與生殖系統、消化系統、呼吸系統、心血管系統等多個系統功能活動的調控[1-3]。臨床資料以及流行病學研究顯示，女性在月經前期、月經期以及懷孕期均會出現效應不一致的胃腸動力改變，不僅會發生腹脹、便秘等胃腸動力障礙[4]，也會發生腹痛、腹瀉等胃腸動力亢進[5,16]。進入更年期的婦女同樣也會產生腹脹、便秘[17-18]或腹痛[19]等不一致的胃腸動力變化。在體試驗中，Fisher等[20]給予成年負鼠17-β-雌二醇處理后發現負鼠的食管下括約肌對乙酰膽堿和胃泌素的反應性降低；Cokun等[6]給予雄性大鼠長期雌激素處理后觀察到大鼠的胃排空活動會被雌激素顯著抑制，且抑制作用隨雌激素劑量的上升而增強；但Ryan和Bhojwani[7]運用雌激素處理卵巢摘除雌性小鼠后卻發現小鼠的胃排空活動以及結腸轉運速度均會顯著加快。離體試驗中，Pines等[8]采用雌二醇處理大鼠回腸后發現其收縮力會隨著雌二醇濃度的增加而逐漸減弱；Hogan等[21]給予人類結腸肌條17-β-雌二醇處理后觀察到結腸平滑肌收縮力在短時間內被顯著抑制；然而田野等[22]用雌激素處理家兔十二指腸和空腸后觀察到它們的收縮力顯著增強；Feng等[10]同時使用催產素和雌激素處理大鼠結腸后也發現其收縮活動顯著增強。本試驗首先通過構建卵巢摘除動物模型，盡可能地降低了內源性雌激素對十二指腸肌電活動的影響。在給予各試驗組家兔不同劑量的苯甲酸雌二醇后，發現十二指腸肌電活動的振幅、頻率以及肌電活動指數等指標均會隨著雌二醇濃度由低到高的增加呈現出一種先升高后降低的變化趨勢，說明雌二醇對十二指腸肌電活動是一種濃度依賴性雙重調節作用。對于雌性動物而言，體內雌激素水平會在月經期、懷孕期等生殖周期為滿足其生理需要而出現明顯的上升，而在絕經期由于卵巢功能的退化會出現明顯的下降，由于雌激素對胃腸運動的影響呈濃度依賴性雙重調節模式，因此在不同生理時期雌激素水平變化不同的情況下，會出現效應不一致的胃腸動力改變。而在實驗室條件下，雌激素給藥濃度的不同會更為直接地引起雌激素調節胃腸運動作用的不同，因而也會引發雌激素調節胃腸運動生物學效應的差異。因此，本試驗從電生理學角度闡明了雌激素濃度與十二指腸運動的關系，并在一定程度上解釋了產生上述雌激素調節胃腸運動效應不一致的原因，這為進一步研究雌激素調節胃腸運動的作用機制提供了一定的理論依據。

表2函數擬合精度分析結果

Table2Reslutsofprecisionanalysisoffunctionfitting

因變量參數Dependent variable parameter函數模型Function model決定系數(R2)Determination coefficientP值P value振幅Amplitudey=0.90+0.12×exp{-0.5 ×[(x - 0.100)/ 0.034]2}0.986 00.147 6頻率Frequencyy=20.25+3.30×exp{-0.5 × [(x - 0.099)/ 0.037]2}0.462 10.031 5肌電活動指數 Myoelectric activity indexy=1.50+3.73×exp{-0.5 × [(x - 0.098)/ 0.035]2}0.995 20.002 0

3.2 苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電影響的數學模型構建

隨著互聯網通訊、計算機技術的不斷發展以及生物學研究與計算機科學的融合，數學方法在生物學研究領域中已發揮越來越重要的作用。不僅僅是經典的統計學分析方法，數學建模也成為數學方法在生物學研究中一項非常重要的應用[23]。王顯金和陽軍[24]采用聚類分析法成功構建了DNA序列分類的數學模型，使DNA分類結果的精度大大提高；馬廷強[25]通過構建腦卒中發病率與平均氣壓、平均氣溫以及平均濕度關系的數學模型，闡明了環境因素與腦卒中發生風險的關系；張靜等[26]通過構建艾滋病患者CD4與HIV濃度關系的數學模型為相關艾滋病療法的治療預測與評價提供了定量化的理論依據。本試驗在進行了振幅、頻率和肌電活動指數的函數擬合精度分析后，根據高斯函數表達式構建了苯甲酸雌二醇劑量與肌電活動指數相互關系的函數：y=1.50+3.73×exp{-0.5×[(x-0.098)/0.035]2}。通過對該函數進行分析，發現苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電活動的影響范圍為1.50～5.23 mV·min-1，這表明雌激素對十二指腸肌電活動的調節作用是在十二指腸本身具備一定水平的肌電活動的基礎上進行的，即雌激素并不是十二指腸肌電活動的直接調控者，它只在有限范圍內間接調節十二指腸的肌電活動。眾所周知，胃腸運動受到神經系統與內分泌系統的雙重調節，而神經系統是其直接的調控者，由腸神經系統、自主神經系統以及中樞神經系統所組成的多層級神經網絡共同完成了對胃腸運動的調節過程[27-28]。董偉等[29]，史雁暇等[30]運用免疫組化SP法分別在雌性山羊的結狀神經節和腹腔腸系膜前神經節上發現雌激素受體的廣泛表達，雌激素受體的存在對于雌激素效應的發揮具有十分重要的意義[31]，結合本試驗的研究結果，提示雌激素對十二指腸肌電活動的調節作用可能是通過與支配消化道功能活動的神經系統的交互作用這一間接途徑完成的。此外根據該函數參數的性質，將肌電活動指數隨雌二醇劑量增加而變化的趨勢以劑量分別為0.063、0.098、0.133 mg·kg-1為分界點，分為連續的指數型增加、對數型增加、指數型減小以及對數型減小4個區間段，這一結果進一步說明了雌二醇對十二指腸肌電活動是一種濃度依賴性雙重調節作用，并且確定了肌電活動發生趨勢變化所對應的雌激素拐點劑量。這些數據如果通過試驗方法獲得不僅需要耗費大量的試驗動物以及時間精力，而且會與真實值產生偏差。該數學模型不僅更為準確地反映了苯甲酸雌二醇對十二指腸肌電活動的作用規律，而且可以在不進行試驗的情況下針對某一特定注射劑量的苯甲酸雌二醇直接計算出相應的肌電活動指數，并由此評估該劑量的苯甲酸雌二醇對十二指腸平滑肌活動的作用。本試驗所構建的函數模型不僅為相關方面的研究提供了雌激素與十二指腸肌電活動的定量關系，極大程度地節省了試驗時間及成本，而且為臨床上和生產實踐中對于雌激素類藥物的研發和使用提供了數據化理論基礎，對生物學研究以及生產應用都具有重要意義。

4 結 論

苯甲酸雌二醇對卵巢摘除雌性家兔的十二指腸肌電活動呈現明顯的濃度依賴性雙重調節作用規律，并且這種作用規律是在十二指腸本身具備一定水平的肌電活動的基礎上完成的，即雌二醇對十二指腸肌電活動的調節是一種間接作用。此外隨雌二醇濃度的增加，十二指腸的肌電活動會依次表現指數型增加、對數型增加、指數型減小以及對數型減小的變化趨勢。本試驗的研究結果闡明了雌激素調節十二指腸肌電活動的定量化作用規律，為進一步研究雌激素在體內調節十二指腸運動的作用機制以及雌激素類藥物的研發和應用均提供了一定理論依據和參考。

致謝：特別感謝西北農林科技大學理學院鄭立飛老師在我完成本論文數學模型構建部分時給予我的悉心指導，使我能順利地完成該論文，在此謹向鄭立飛老師致以誠摯的感謝和崇高的敬意。