牦牛和柴達木黃牛低氧通氣反應及頸動脈體NO、NOS的比較研究

張 壽，靳國恩，常 蘭*，呂 軍，沈明華，劉 惠，顧海燕，雷乃虎

(1.青海大學農(nóng)牧學院，西寧 810016； 2.青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心，西寧 810001； 3. 青海省天峻縣畜牧獸醫(yī)工作站，天峻 817200)

增加肺的通氣量是平原動物(包括人)進入高原后迅速適應高原低氧環(huán)境的反應之一。資料報道急性高山病(acute mountain sickness，AMS)[1-2]的發(fā)病率與人的相對低通氣量有關(guān)，增加通氣量是防制AMS發(fā)生的主要措施之一。許多學者對人和動物有關(guān)低氧通氣反應及其發(fā)生機制進行了大量研究，如Chiodi[3]報道美洲高原印第安人存在低氧通氣反應(hypoxic ventilatory response，HVR)減弱和肺通氣功能降低的趨勢；Hodges等[4]對3個近交系大鼠品種和1個遠交大鼠品種進行了對比試驗研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HVR受基因多樣性的影響，不同品種的大鼠在低氧時呼吸表型(如頻率、節(jié)奏)也不一樣。Strohl等[5]報道HVR還受大鼠品種、個體、性別的影響，且品種是主要的影響因素。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的每分通氣量、頻率、潮氣量均與品種有關(guān)(如每分通氣量SD大鼠大于K大鼠、Z大鼠，頻率BN大鼠大于K大鼠，潮氣量SD大鼠大于BN大鼠、K大鼠、Z大鼠)。Ye等[6]研究發(fā)現(xiàn)大鼠頸動脈體(carotid body，CB)中低氧所誘導的一氧化氮(nitric oxide，NO)增加可以促進其對慢性低氧的適應性，而且結(jié)構(gòu)性一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)和誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)參與了NO生成，在慢性低氧時NO生成增多又可鈍化CB對低氧化學感受的敏感性等。有關(guān)高原牦牛頸動脈體形態(tài)學方面的研究我們已有報道[7-8]，但對牦牛HVR及其機制方面鮮有研究。為此，我們對生活在青藏高原(海拔3 200 m) 低氧環(huán)境中牦牛的HVR及NO、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)含量與柴達木黃牛進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取青海省海西蒙古族藏族自治州(海拔3 200 m)臨床健康的成年雌性牦牛和柴達木黃牛各10頭進行低氧(13.9% O2)通氣反應，經(jīng)頸動脈放血處死后立即分離出CB投入液氮中，待用于ELISA雙抗體夾心法檢測。在屠宰季節(jié)另選取海拔3 200 m成年健康牦牛和柴達木黃牛各10頭處死，迅速取出CB，其中左側(cè)CB置入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.4) 中固定，用于免疫組織化學染色；右側(cè)CB投入液氮中，分別用于ELISA雙抗體夾心法檢測和熒光定量PCR。

1.2 方法

1.2.1 低氧通氣反應 牛保定后牛耳剪毛便于檢測血氧飽和度(SaO2)。戴上呼吸面罩(面罩呼氣口連接多功能生理信號采集系統(tǒng))后，在常氧下呼吸5～10 min，用MP150型多導電生理記錄儀(16通道)(美國Biopac公司)描記連續(xù)呼吸曲線，并用YX301型脈搏血氧儀測定血氧飽和度(SaO2)；吸入低氧(13.9% O2)混合氣體(模擬海拔6 000 m)12 min，重復記錄上述內(nèi)容；根據(jù)MP150型多導電生理記錄儀記錄的呼吸曲線采集潮氣量(TV)、呼吸頻率(Bf)，計算每分通氣量(VE)=TV×Bf(60 s)，用吸入低氧后SaO2下降和VE增加的絕對值的比值(ΔVE/ΔSaO2)來計算低氧通氣反應的斜率。

1.2.2nNOS、eNOS和iNOS基因表達鑒定

1.2.2.1 總RNA提取和cDNA合成：用TRIZOL法提取海拔3 200 m牦牛和柴達木黃牛CB總RNA，選取OD260 nm/OD280 nm值介于1. 8 ～ 2. 0、濃度大于或等于0.1 μg·μL-1者，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，總RNA電泳采用4.5 V·cm-1電泳強度，采用First Strand cDNA Synthesis Kit(上海索寶生物公司)將提取鑒定的總RNA逆轉(zhuǎn)錄，并合成cDNA，并將逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物保存于-20 ℃。

1.2.2.2 基因擴增引物設計：采用NCBI登錄GenBank，分別下載牛(Bostaurus，XM_015467111、NM_181037、NM_001076799)的nNOS、eNOS和iNOSmRNA序列，然后根據(jù)引物設計專用軟件Primer Premier 5.0在基因序列保守區(qū)域設計特異性擴增引物，設計引物序列見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1牦牛和柴達木黃牛nNOS、eNOS和iNOS熒光定量PCR引物

Table1FluorescencequantitativePCRprimerofnNOS,eNOSandiNOSofyakandQaidamyellowcattle

基因Gene引物序列(5'→3')Primers sequence產(chǎn)物長度/bpProduct length退火溫度/℃Annealing temperaturenNOSAGCACCTTTGGCAATGGAGACCC16860GAGGAAACGCTGTTGAAACGCACCeNOSGTTCCCTCGCGTGAAGAACT19959CTGGTTGATGAAGTCCCTGGCiNOSCTTGTTCTCGAGGTGCCCAT17460GTCCCGGACTCCAACTTCTG

1.2.2.3 熒光定量PCR檢測：按照Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR GreenⅠ) 說明書，取GAPDH標準品及樣品等配制反應體系。配好PCR反應體系，放置于ABI7500 PCR儀上進行PCR反應。根據(jù)ABI7500預設條件，成倍稀釋cDNA完成反應標準曲線，確保樣品待測基因與內(nèi)參照基因的擴增效率一致。

1.2.3 nNOS、eNOS和iNOS蛋白表達鑒定 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法測定海拔3 200 m和模擬海拔6 000 m的牦牛和柴達木黃牛CB組織中nNOS、eNOS和iNOS蛋白(美國R&D公司ELISA kit試劑盒，購自北京誼普生生物公司)。各步驟均嚴格按說明書進行。每項檢測均設3個復孔。

1.2.4 免疫組化染色步驟 海拔3 200 m牦牛和柴達木黃牛CB經(jīng)4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定、常規(guī)脫水、透明、包埋、連續(xù)切片，片厚4 μm，隔50取4，分成4套，其中3套分別用于nNOS、eNOS和iNOS多克隆抗體免疫組化SP法染色，另外1套進行陰性對照。用于免疫組化染色的切片依次常規(guī)脫蠟至水、枸櫞酸修復液高壓修復、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液孵育、非免疫動物血清(羊) 后分別入一抗(兔源性nNOS、eNOS和iNOS多克隆抗體，1∶200，武漢博士德公司)、置冰箱4 ℃過夜、生物素標記的羊抗兔IgG、HRP標記的鏈霉卵白素-抗生物素溶液(SP試劑盒，福州邁新公司)、DAB顯色液呈色，各步驟間PBS液洗(非免疫動物血清和一抗間不洗)、蘇木素染液復染、脫水、透明、封片。陰性對照試驗用PBS液代替一抗。

光鏡下觀察切片，用圖象采集系統(tǒng)數(shù)碼照相，牦牛、柴達木黃牛各5頭，每頭牛CB組織取5張切片，每張nNOS、eNOS和iNOS陽性切片選取著色最深視野拍照 2～3張，每個因子共計60張。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(德國)分析照片，計算陽性區(qū)域平均光密度值(Mean optical density，MOD)。

2 結(jié) 果

2.1 NOS基因mRNA在海拔3 200 m牦牛和柴達木黃牛CB表達差異

牦牛頸動脈體中nNOS基因mRNA表達水平高于柴達木黃牛，而eNOS、iNOS基因mRNA表達水平分別低于柴達木黃牛，差異均不顯著(P>0.05)(表2)。

組別Group神經(jīng)型一氧化氮合成酶nNOS內(nèi)皮型一氧化氮合成酶eNOS誘導型一氧化氮合成酶iNOS牦牛Yak2.99±2.070.97±0.541.59±0.82柴達木黃牛Qaidam yellow cattle0.60±0.241.26±0.172.97±2.41

與柴達木黃牛組比較，*.P<0.05; **.P<0.01

*.P<0.05vsQaidam yellow cattle group; **.P<0.01vsQaidam yellow cattle group

2.2 急性低氧(13.9%O2)下牦牛和柴達木黃牛HVR比較

牦牛、柴達木黃牛在常氧下(海拔3 200 m)VE分別為(46.62±13.99)和(22.76±8.97) L·min-1(P<0.01)，SaO2為(89.80±4.34)%和(85.25±6.76)% (P>0.05)；吸入低氧混合氣體(13.9% O2)后，VE分別為(50.11±13.86)和(30.20±8.29) L·min-1(P<0.01)，SaO2下降至(71.92±8.43)%和(69.66±6.18)% (P>0.05)。故低氧通氣反應的斜率(VE的增加和SaO2下降的絕對值的比值即兩組△VE/△SaO2)分別為(0.21±0.10)和(0.50±0.21) (L·min-1)/% SaO2(P<0.01)。

2.3 急性低氧(13.9%O2)下牦牛和柴達木黃牛頸動脈體中NOS和NO比較

由表3可知，生活在海拔3 200 m組(即常氧下)牦牛CB中nNOS、eNOS、iNOS活性和NO含量分別與柴達木黃牛的相比均沒有顯著差異(P>0.05)。在急性低氧(13.9%O2)組(模擬海拔6 000 m組)中，牦牛CB中nNOS、eNOS、iNOS活性分別與柴達木黃牛相應值相比無顯著差異(P>0.05)，但牦牛CB中NO含量明顯高于柴達木黃牛(P<0.01)；急性低氧(13.9%O2)組的牦牛和柴達木黃牛CB中nNOS、eNOS、iNOS與海拔3 200 m組的相應值比較，均無顯著差異(P>0.05)，而NO含量均分別明顯高于海拔3 200 m 組(P<0.01，P<0.05)。

2.4 NOS蛋白在牦牛和柴達木黃牛CB中表達的形態(tài)學差異

由圖1和表4可以看出，CB實質(zhì)由大量的圓形或橢圓形的小球密集組合而成，小球主要由分布于其外圍的“C”型并成簇排列的球細胞組成。NOS的nNOS、eNOS、iNOS蛋白在牦牛和柴達木黃牛CB中均有表達，且主要表達于CB成簇的球細胞中；牦牛nNOS和iNOS蛋白水平表達顯著高于柴達木黃牛，差異均極顯著(P<0.01)，而eNOS蛋白水平表達極顯著低于柴達木黃牛(P<0.01)。

3 討 論

平原人暴露在高原后HVR會增強，肺的通氣量也增大[9]。研究還表明高原世居人對HVR遲鈍[3,10-12]，Severinghaus等[11]、Lahiri和Milledge[12]分別在對玻利維亞的印第安人和喜馬拉雅的舍巴人的研究中獲得了同樣的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)外周化學感受器去敏感性可導致高原世居人的HVR遲鈍，這種去敏感現(xiàn)象發(fā)生于長期暴露在高原低氧環(huán)境下的幾代人當中。楊生岳等[13]對平原移居至海拔4 750 m 20～80 d的漢族(短居組)、3～20年的漢族(久居組)和當?shù)厥谰硬刈?世居組)進行了HVR研究，結(jié)果表明，短居高原漢族的HVR較久居高原漢族和世居高原藏族敏感，且后兩組HVR遲鈍但無明顯差異，說明久居高原漢族的HVR也變得遲鈍，并獲得與世居高原藏族相似的HVR。但也有高原世居人對HVR并不遲鈍的報道，孫新甫等[14]對海拔3 658 m高原(拉薩)世居藏族及已習服的移居漢族的HVR進行了比較，發(fā)現(xiàn)世居組HVR高于移居組。而格日力等[15]對居住在青藏高原海拔2 000～3 000 m (中海拔)和4 000～4 700 m (高海拔)地區(qū)藏族的低氧(12% O2)通氣反應進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中海拔組對低氧的刺激反應保持著較高的通氣反應，而高海拔組則顯示鈍化，認為高原人通氣反應的鈍化與居住地的海拔高度有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)吸入低氧(13.9% O2)后，牦牛SaO2下降的程度略大于柴達木黃牛，且每分通氣量的增加量在牦牛和柴達木黃牛間有明顯差異，即牦牛VE增加的絕對值小于柴達木黃牛。因此，△VE/△SaO2的斜率明顯減小，說明牦牛比柴達木黃牛有著較低的HVR。

組別Group海拔3 200 m組 Altitude 3 200 m group低氧(13.9%O2)組Hypoxia(13.9%O2)groupnNOS/(ng·mL-1)eNOS/(ng·mL-1)iNOS/(pg·mL-1)NO/(nmol·mL-1)nNOS/(ng·mL-1)eNOS/(ng·mL-1)iNOS/(pg·mL-1)NO/(nmol·mL-1)牦牛Yak8.92±2.264.02±1.40205.36±29.3520.15±7.519.59±1.414.19±1.27312.25±53.2459.74±8.67**##柴達木黃牛Qaidam yellow cattle7.15±2.904.69±1.07218.15±16.949.58±2.648.29±2.023.09±0.16250.02±32.4126.08±4.74#

與柴達木黃牛組比較，**.P<0.01；與海拔3 200 m組比較，#.P<0.05, ##.P<0.01

**.P<0.01vsQaidam yellow cattle group;#.P<0.05,##.P<0.01vsaltitude 3 200 m group

A～C. 牦牛；D～F. 柴達木黃牛；A、D. nNOS；B、E. eNOS；C、F. iNOS;.小球.↑.球細胞A-C. Yak; D-F. Qaidam yellow cattle; A, D. nNOS; B, E. eNOS; C, F. iNOS;.Globule;↑.Globule cell圖1 牦牛和柴達木黃牛CB中nNOS、eNOS、iNOS蛋白表達(免疫組織化學染色40×)Fig.1 The expression of nNOS, eNOS and iNOS in carotid body of yak and Qaidam yellow cattle (Immunohistochemical staining 40×)

組別Group神經(jīng)型一氧化氮合成酶nNOS內(nèi)皮型一氧化氮合成酶eNOS誘導型一氧化氮合成酶iNOS牦牛 Yak0.20±0.02**0.18±0.02**0.27±0.04**柴達木黃牛 Qaidam yellow cattle0.16±0.020.19±0.010.19±0.01

與柴達木黃牛組比較， **.P<0.01

**.P<0.01vsQaidam yellow cattle group

一般認為HVR的減弱與CB的結(jié)構(gòu)或生化改變有關(guān)。Donovan等[16]研究發(fā)現(xiàn)BN大鼠在低氧環(huán)境下表現(xiàn)出較低的急性通氣反應，而SD大鼠呈現(xiàn)較高的通氣反應，但BN大鼠TH陽性和nNOS陽性區(qū)域均大于SD大鼠。Ⅰ型細胞中線粒體被認為與CB氧感受有關(guān)，我們先前的研究表明牦牛Ⅰ型細胞線粒體數(shù)量明顯少于柴達木黃牛[8]，牦牛也有著比柴達木黃牛較低的HVR。另外，在常氧下(海拔3 200 m)牦牛通氣量(46.62±13.99) L·min-1，顯著大于柴達木黃牛的(22.76±8.97) L·min-1，這也可能是牦牛比柴達木黃牛有著較低HVR的原因之一。

急性氧感受是個體在低氧狀態(tài)下生存的必要條件。CB是主要的外周化學感受器，其含調(diào)節(jié)離子通道含有的易興奮和氧敏感的球細胞。機體暴露于急性低氧環(huán)境下，K+通道的抑制是觸發(fā)細胞去極化、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和刺激腦干呼吸中樞產(chǎn)生超通氣的感覺纖維激活信號。最新的研究表明[17]，大鼠兩側(cè)CB去神經(jīng)后5周，呼吸節(jié)奏緩慢而不規(guī)律，10周后呼吸頻率與假手術(shù)組間無差異，但呼吸節(jié)奏的規(guī)律性仍然在減少。增加隨機呼吸暫停的頻率可能是CB去神經(jīng)后產(chǎn)生不規(guī)則呼吸模式的原因。在常氧下NO能增加去化學感受效應，而在低氧條件下，NO是CB化學感受的主要抑制調(diào)節(jié)器，它直接調(diào)節(jié)球細胞和巖神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，間接調(diào)節(jié)血管緊張性和氧傳遞[18]。Fung等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧狀態(tài)下大鼠CB中內(nèi)源性NO生成增多，NO的升高可抑制頸動脈化學感受器對低氧的反應。NOS催化L-精氨酸而生成NO。Valdés等[20]報道，在貓CB中nNOS和eNOS都參與NO的生成，但eNOS是NO的主要來源，并且加強化學感受活動。本研究中，海拔3 200 m(常氧下)，牦牛頸動脈體中nNOS基因mRNA和蛋白表達水平、NO含量均高于柴達木黃牛，而eNOS、iNOS基因mRNA和蛋白表達水平分別低于柴達木黃牛，但差異均不顯著(P>0.05)；免疫組化的研究結(jié)果表明牦牛CB中nNOS也高于柴達木黃牛(P<0.01)， eNOS蛋白水平表達也低于柴達木黃牛(P<0.01)，但iNOS蛋白水平表達卻高于柴達木黃牛(P<0.01)，說明牦牛CB中nNOS、eNOS蛋白含量最高區(qū)域的平均光密度值均高于柴達木黃牛，而iNOS蛋白含量最高區(qū)域的平均光密度值低于柴達木黃牛。急性低氧(13.9% O2)組(模擬海拔6 000 m)牦牛和柴達木黃牛CB中nNOS、eNOS、iNOS活性分別大于海拔3 200 m 組，相應指標差異均不顯著(P> 0.05)，而NO含量則顯著高于海拔3 200 m組(P<0.01，P<0.05)，并且在急性低氧(13.9%O2)(模擬海拔6 000 m) 狀態(tài)下，牦牛頸動脈體中NO含量極顯著高于柴達木黃牛(P<0.01)，可見急性低氧可導致牦牛和柴達木黃牛CB中產(chǎn)生大量NO，且牦牛明顯多于柴達木黃牛。綜上所述，在急性低氧條件下牦牛CB中高含量的NO阻止了CB對低氧的感受，同時鈍化了牦牛的HVR。

4 結(jié) 論

青藏高原世居牦牛低氧通氣反應鈍化，而柴達木黃牛對低氧的刺激保持較高的通氣反應，急性低氧時牦牛CB內(nèi)產(chǎn)生大量的NO可抑制對低氧的化學感受。