牛冠狀病毒RT-PCR檢測方法的建立及應用

何琪富，郭紫晶，李 然，周 軍，岳 華，2，張 斌，2，湯 承，2*

(1. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2.國家民委青藏高原動物疫病防控創新團隊，成都 610041)

牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)可以引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道疾病，該病毒在世界范圍內流行，給養牛業造成了巨大的經濟損失[1]。BCoV屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬2a亞群，其基因組是RNA病毒中最大的，長度為27～32 kb ，主要包括2個開放閱讀框(ORF1a和ORF1b)和5個結構蛋白：血凝素酯酶蛋白(HE)、纖毛蛋白(S)、小膜蛋白(E)、跨膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)。編碼核衣殼蛋白的N基因高度保守，常作為BCoV的分子檢測的靶基因[2]。

RT-PCR方法是病原檢測和流行病學調查的主要方法，目前國內外已建立了多種檢測BCoV RT-PCR方法，靶基因多為N基因[2-9]，也有選擇編碼跨膜蛋白的M基因[10]。最近作者實驗室采用國外BCoV診斷和流行病學調查常用的RT-PCR方法[2]，以及國內常用的RT-PCR方法[3]復核宏病毒組技術證實為BCoV陽性的牛腹瀉糞便樣本時，結果兩種方法均未能檢出BCoV，其原因有待于進一步研究。本試驗的目的是建立靈敏度更高的BCoV RT-PCR檢測方法，應用該方法對川西北草原牦牛腹瀉糞便樣本和患呼吸道疾病綜合征的牦牛鼻腔棉拭子進行BCoV的檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株、臨床樣本

BCoV陽性株，用于特異性驗證的病毒(菌)株及核酸樣本：牛輪狀病毒(bovine rotavirus virus，BRV)、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)Swun0603、牛星狀病毒(bovine astrovirus，BAstV)Swun0201、牛腸炎病毒(bovine enterovirus，BEV)Swun0510、牛細小病毒(bovine parvovirus，BPV)、牛kobu病毒(bovine Kobu virus，BKV)、牛源K99大腸桿菌Swun4025、牛源都柏林沙門菌Swun3736、牛源產氣莢膜梭菌Swun2930、牛源空腸彎曲桿菌Swun1639、牛源艾美爾球蟲、牛源安氏隱孢子蟲的核酸樣本由本實驗室保存。

用于檢測方法比較的樣本：56份3～6月齡肉牛腹瀉糞便樣本(2017年采自四川省4個養殖場)、57份3～6月齡肉牛有明顯呼吸道疾病癥狀的鼻拭子(2017年采自四川省4個養殖場)、20份3月齡以內牦牛腹瀉糞便樣本(2015年采自四川省紅原縣)、20份3月齡以內牦牛有明顯呼吸道疾病癥狀的鼻拭子(2015年采自四川省紅原縣)。

用于流行病學調查的樣本：125份3月齡以內牦牛腹瀉糞便樣本(2016年6～8月采自四川省阿壩藏羌自治州紅原縣、若爾蓋縣、阿壩縣的8個牧場)、98份6月齡以內有咳嗽、流鼻涕等明顯呼吸道疾病癥狀牦牛的深部鼻腔拭子樣本(2016年7～10月 采自四川省阿壩藏羌自治州紅原縣、若爾蓋縣、阿壩縣的7個牧場)。所有樣本于-80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTMReagent、PrimeScriptTM、PMD19-T克隆載體等購于TaKaRa公司；DNA Marker、DH5α感受態細胞、質粒提取試劑盒購于寶生物工程(大連)股份有限公司；AXY prepTMDNA膠回收試劑盒購于Axygen公司；紫外分光光度計Cary50Probe(Vatian公司，美國)；凝膠成像系統Doc2000(Bio-Rad公司，美國)；高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.3 檢測引物的設計與合成

在對GenBank收錄的全部19條BCoV全基因組序列及本實驗室宏病毒組數據(GenBank accession number：srp 108885)生物信息學分析的基礎上，選擇比N基因更為保守的聚合酶基因Nsp7-Nsp9片段設計特異性檢測引物，引物序列：F:5′-CGAGTTGAACACCCAGAT-3′ R:5′-GAGACGG-GCATCTACACT-3′，見表1，擴增長度為230 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 核酸提取

將臨床糞便樣本及呼吸道樣本與PBS(1∶5)充分重懸混勻，-80 ℃冰箱中反復凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，再以12 000 r·min-1離心30 min，取上清，然后按照Trizol Reagent說明書提取總RNA，并按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存備用；DNA提取采用酚-氯仿法，-20 ℃保存備用。

1.5 陽性質粒的制備

以BCoV陽性cDNA為模板，加入本試驗設計檢測引物進行PCR反應，PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選出陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃培養8 h，用質粒提取試劑盒提取重組質粒，送生工生物有限公司測序。

1.6 反應體系及條件的優化

采用25 μL體系(預混酶12.5 μL，BCoV陽性標準品1.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補足至25 μL)，對退火溫度從45～55 ℃進行優化，再以優化的退火溫度對濃度為10 μmol·μL-1的引物用量(0.5～1.5 μL)進行優化。

1.7 特異性評價

用本實驗建立的RT-PCR方法對“1.1”中待檢病原的核酸樣本進行檢測，并設立標準陽性樣本和陰性對照，以評價該方法的特異性。

1.8 重復性評價

用本試驗建立的RT-PCR方法對3個陽性模板及3份陰性樣本進行3次重復檢測，以評價方法的重復性。

1.9 敏感性測定

將牛CoV陽性標準品10倍遞增稀釋后作為模板(1×100、1×10-1～1×10-6)，對本試驗建立的RT-PCR方法進行檢測，確定檢測下限。

1.10 三種RT-PCR方法的比較

1.10.1 三種方法對臨床樣本中BCoV檢出率的比較 采用所建立的RT-PCR方法和文獻[2]、[3]報道的檢測BCoV的RT-PCR方法同時對56份肉牛、20份牦牛腹瀉糞便樣本、57份肉牛及20份牦牛呼吸道鼻腔拭子進行檢測，比較這3種方法的檢出率，引物信息見表1，三種方法檢測為陽性的PCR產物全部送公司測序。

表1RT-PCR方法的引物信息表

Table1PrimersinformationforthreekindsofRT-PCRassay

檢測方法Test method靶基因Target gene引物序列Primer sequence引物來源Source of primers1聚合酶基因F:5'-CGAGTTGAACACCCAGAT-3'本研究R:5'-GAGACGGGCATCTACACT-3'2NF:5'-GCAATCCAGTAGTAGAGCGT-3'[2]R:5'-CTTAGTGGCATCCTTGCCAA-3'3NF:5'-GAGCGTCCTTTGGAAATCGT-3'[3]R:5'-GCTTAGTTACTTGCTGTGGC-3'

1.10.2 三種方法的靈敏度比較 利用文獻[2]和文獻[3]中檢測引物進行PCR反應，產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選出陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃培養8 h，用質粒提取試劑盒提取重組質粒，送生工生物有限公司測序。將陽性質粒10倍遞增稀釋后作為模板(1×100、1×10-1～1×10-6)，比較三種RT-PCR檢測方法的檢測下限。

1.11 臨床樣本中BCoV的檢測

采用本試驗建立的RT-PCR方法對2016年采自川西北草原的125份牦牛腹瀉糞便樣本以及98份 有咳嗽、流鼻涕等明顯呼吸道疾病癥狀牦牛的深部鼻腔拭子樣本進行BCoV的檢測，分析牦牛CoV在川西北草原的流行情況。

2 結 果

2.1 優化的RT-PCR反應體系及條件

優化的RT-PCR反應體系及條件：預混酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·μL-1)各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O補足25 μL。反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s；49 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min；16 ℃ 反應結束。

2.2 方法的特異性

該方法能從BCoV陽性樣本中檢出目的基因片段，對BRV、BVDV、BAstV、BEV、牛細小病毒、牛Kobu病毒、牛源K99大腸桿菌、牛源都柏林沙門菌、牛源產氣莢膜梭菌、牛源艾美爾球蟲、牛源安氏隱孢子蟲的核酸樣本無擴增。

2.3 方法的重復性

用本試驗設計的檢測引物對同一模板3次重復檢測結果一致，證明該方法有良好的重復性(結果未展示)。

2.4 方法的敏感性

對“1.5”中所制備陽性標準品質粒濃度進行測定，質量濃度為100 ng·μL-1，敏感性檢測結果顯示，在1×107稀釋度陽性標準品仍可見目的條帶，對BCoV的核酸最低檢測限為1×10-2pg· μL-1,說明本試驗設計方法具有較好的靈敏性。

2.5 三種檢測BCoV方法的比較

2.5.1 三種檢測BCoV方法對臨床樣本的檢出率 三 種方法對臨床樣本中BCoV的檢出率見表2，檢出的全部陽性PCR產物測序結果證實均為BCoV基因片段。方法2和方法3檢出BCoV陽性的數量和編號一致，且本試驗建立的方法檢出的陽性樣本包含了方法2、3檢測的全部樣本。可見本試驗建立的RT-PCR方法對肉牛和牦牛的BCoV檢測都有良好的檢測效果。

表2三種方法檢出率比較

Table2ThedetectionrateofthreekindsofRT-PCRassay

檢測方法Test method肉牛樣本類型及結果Sample type and results of beef cattle牦牛樣本類型及結果Sample type and results of yak腹瀉糞便(n=56)呼吸道(n=57)腹瀉糞便(n=20)呼吸道(n=20)方法來源Source of primers112.50%(7/56)12.28%(7/57)75.00%(15/20)70.00%(14/20)本研究25.36%(3/56)7.02%(4/57)15.00%(3/20)20.00%(4/20)[2]35.36%(3/56)7.02%(4/57)15.00%(3/20)20.00%(4/20)[3]

2.5.2 三種檢測BCoV方法的靈敏度 利用核酸蛋白濃度分析儀測量三種陽性標準品質粒濃度均為100 g·μL-1，敏感性檢測結果顯示，本試驗所建立的方法的靈敏度為1×10-2pg·μL-1，參考文獻[2]報道方法和參考文獻[3]報道方法的靈敏度分別為1×100、1×101pg·μL-1。本試驗建立方法靈敏性比參考文獻[2]報道的方法的靈敏性高了兩個數量級，比參考文獻[3]報道的方法的靈敏性高了三個數量級。

2.6 臨床樣本中BCoV的檢測

利用本試驗建立的RT-PCR檢測方法對2016年6—8月份采自四川省阿壩藏羌自治州紅原縣、若爾蓋縣、阿壩縣的125份犢牦牛腹瀉糞便樣本以及98份有呼吸道疾病綜合征的牦牛鼻腔拭子進行BCoV的檢測，結果如表3、表4所示。對檢出的陽性樣本隨機挑選20%進行測序，證實檢出無誤，同時也進一步驗證本試驗建立的RT-PCR方法檢測結果的準確性。

表3牦牛腹瀉樣本中BCoV的檢出率

Table3ThedetectionrateofyakBCoVinfectionindiarrheasamples

牧場 FarmsABCDEFGH合計 Total樣本數/份 Samples181930101051320125陽性樣本數/份 Positive samples13132177491589陽性率/% Positive rates72.2268.4270.0070.0070.0080.0069.2375.0071.20

表4牦牛呼吸道樣本中BCoV的檢出率

Table4ThedetectionrateofyakBCoVinfectioninnasalcavitysamples

牧場 FarmsABCDEFG合計 Total樣本數/份 Samples1515101517141298陽性樣本數/份 Positive samples11107111310971陽性率/% Positive rates73.3366.6770.0073.3376.4771.4375.0072.45

3 討 論

犢牛腹瀉是臨床上最常見的一類疾病，給養牛業造成了嚴重損失。犢牛腹瀉病因復雜，其中病原微生物感染是造成牛腹瀉的重要原因，引起犢牛腹瀉的常見病毒有BCoV、BRV、BVDV[11-12]。并且有新的致腹瀉病毒出現，如諾如病毒、Nebovirus等[13-14]，使診斷更加困難。本實驗室前期用宏病毒組技術無偏差鑒定犢牛腹瀉樣本中病毒種類時，發現存在BCoV核酸序列(GenBank accession number：srp 108885)，但采用國外BCoV診斷和流行病學調查常用的RT-PCR方法[2]以及國內常用的RT-PCR方法[3]進行復核時，兩種方法均未能檢出。由于BCoV是危害養牛業重要病原之一，因此有必要建立新的RT-PCR方法，以提高對臨床樣本中BCoV的檢出率。鑒于采用的兩個以N基因為檢測靶點的RT-PCR方法未能檢出宏病毒組技術證實為BCoV陽性的牛腹瀉糞便樣本。因此，我們對GenBank中全部19條BCoV的聚合酶基因以及47條N基 因的序列進行生物信息學分析，發現N基因變異率為0.011，超過20%毒株在同一位點發生變異比例為0.014(20/1 470)；聚合酶基因Nsp7-Nsp9序列變異率為0.004，超過20%毒株在同一位點發生變異比例為0.003(10/3 193)，其變異率顯著低于N基因變異率。同時，聚合酶基因在人和動物的CoV中也是常用的分子檢測靶點[15-16]。因此，根據BCoV聚合酶基因Nsp7-Nsp9片段設計引物，成功建立方法，特異性和重復性好，靈敏性是目前BCoV RT-PCR檢測方法中最高的[2-3]，對肉牛和牦牛都有很好的檢測效果，為BCoV的檢測和流行病學調查提供了有力工具。

關于牦牛BCoV的流行病學資料很少，還沒有見到關于病原流行病學調查的報道。但從僅有的3篇 相關牦牛血清流行病學調查[17-19]數據表明，BCoV的血清陽性率很高。川西北草原屬青藏高原東南緣，是我國五大牧區之一，也是我國主要的牦牛養殖地區之一。由于青藏高原特殊的自然地理環境，牦牛產犢主要集中在4—5月份，犢牛腹瀉導致發病率和死亡率都很高，造成嚴重損失[20]。作者對2016年6—8月采自該地區犢牛腹瀉糞便樣本調查表明，BCoV場陽性率8/8，樣本陽性率71.20%，表明川西北牦牛腹瀉樣本中BCoV檢出率很高。鑒于BCoV是犢牛腹瀉、成年牛冬痢的重要病原，可以確定BCoV是川西北牦牛腹瀉的重要原因，為犢牛腹瀉的防控提供了科學依據。

牛呼吸道疾病綜合征是危害養牛業的另一大類疾病[21-22]，其中病毒感染是重要病因。常見的病毒有BPIV3、BVDV、IBRV、BCoV、BRSV等[23-27]。病毒感染后損害呼吸道黏膜的完整性引起發病，在細菌、支原體等混合/繼發感染時病情加重[28-29]。呼吸道疾病綜合征也是牦牛多發病，但目前未見關于牦牛呼吸道疾病綜合征的病原流行病學資料。對2016年 川西北草原牦牛98份呼吸道樣本進行病原學 檢測，牦牛CoV 場陽性率是7/7，樣本陽性率72.45%。BCoV不僅可以引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢，而且是牛呼吸道疾病綜合征的重要病因[25,30]。因此，在川西北牦牛呼吸道疾病綜合征中BCoV扮演著重要角色。

4 結 論

成功建立BCoV的RT-PCR檢測方法，該方法特異性和重復性好，靈敏性達到1×10-2pg·μL-1，為BCoV 的檢測和流行病學調查提供了新的技術手段；流行病學調查結果顯示川西北草原牦牛腹瀉糞便樣本和表現有呼吸道疾病癥狀牦牛的深部鼻腔拭子中BCoV陽性率很高，證明BCoV是川西北草原牦牛腹瀉和呼吸道疾病綜合征的重要病原。