豆漿豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性的研究

孫雪飛，于寒松，2，*，谷春梅，*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.國家大豆產業技術研究開發中心加工研究室，吉林長春130118）

中國是大豆的故鄉，同時也是最早研發生產豆制品的國家。豆制品是平衡膳食的重要組成部分。大豆營養價值豐富，是人和動物的主要蛋白質來源，很多人把豆漿、豆腐作為必選的早餐之一[1-2]。但由于其含有多種抗營養因子，阻礙營養物質的吸收，因此很大程度上限制了大豆的直接利用[5-6]。胰蛋白酶抑制因子是最主要的一類抗營養因子[7-8]，約占大豆蛋白的6%。大豆胰蛋白酶抑制因子的含量受多種因素的影響，例如大豆的品種以及加工工藝等[9-10]。隨著科學技術的發展，多種鈍化或消除胰蛋白酶抑制因子的技術不斷涌出，可以概括為物理法、化學法和生物學方法[11]。

本研究采用干法生漿（dry soybean-boiling after filtration，DS-BAF）、干法熟漿（dry soybean-boiling before filtration，DS-BBF）、濕法生漿（soaked soybeanboiling after filtration，SS-BAF）、濕法熟漿（soaked soybean-boiling before filtration，SS-BBF）、發芽豆生漿（germination soybean-boiling after filtration，GS-BAF）、發芽豆熟漿（germination soybean-boiling before filtration，GS-BBF），6種制漿工藝并以克山1號、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10等5種大豆為原料進行豆漿制備[12-13]，測定大豆中蛋白質及豆漿中水溶性蛋白，并以CaSO4為凝固劑制備豆腐[14-15]，通過分析豆漿、豆腐產量與豆漿蛋白含量的關系，在保證豆制品產率的同時對其進行胰蛋白酶抑制因子活性的測定[16-17]，得出產量最大、蛋白質含量最高、胰蛋白酶抑制因子活性最低的品種以及最佳加工工藝，對于工業化生產中降低胰蛋白酶抑制因子含量，提高產品產率及豆制品加工適用性具有重要意義[18-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克山1號、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10：東北農業大學試驗站提供。

胰蛋白酶、苯甲酰－dl－精氨酸－p－硝基酰替苯胺鹽酸鹽（benzoyl-DL-arginine-P-nitroanilide hydrochloride，BAPA）、二甲基亞砜溴甲酚綠、硼酸、氫氧化鈉、甲基紅、亞甲基藍：北京鼎國有限公司。

1.2 儀器與設備

RU-190紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FD-IB-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器公司；3-18k臺式冷凍離心機：德國SIGM公司；ULT-1386-3-V-80℃超低溫冰箱：Thermo公司；C21-WK2102電磁爐：廣東美的電器制造有限公司；-4℃低溫冰柜：Haier公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱：精宏儀器有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將5種大豆分別粉碎后過100目篩，準確稱量1.0000g（精確至0.002g）于250mL錐形瓶中，用50 mL濃度為0.006 mol/L的氫氧化鈉溶液在25℃、150 r/min條件下提取0.5 h后，用1 mol/L氫氧化鈉或1 mol/L鹽酸將溶液的pH值調為9.5～9.8，繼續提取2.5 h后，4 000 r/min離心10 min，棄沉淀留上清。

1.3.2 豆漿及豆腐的制備工藝

1.3.2.1 豆漿的制備

干法生漿：干燥——磨漿——過濾——水浴——煮沸——熟豆漿。

干法熟漿：干燥——磨漿——水浴——煮沸——過濾——熟豆漿。

濕法生漿：浸泡——磨漿——過濾——水浴——煮沸——熟豆漿。

濕法熟漿：浸泡——磨漿——水浴——煮沸——過濾——熟豆漿。

大豆的發芽：將130 g質地優良的大豆放入盆中，用水清洗2次～3次，然后用80℃水浸泡5 min，迅速沖入45℃溫水，浸泡3 h～4 h后將豆子撈出，在上面覆蓋2層紗布避光，放入25℃恒溫培養箱，每隔5小時～6小時淋一次水，3天后使用。

1.3.2.2 豆腐的制備

稱取130g無雜的優質大豆，清洗后加入650mL的蒸餾水浸泡 14 h～16 h，瀝干后按照豆：水為1∶9（g/mL）加入蒸餾水進行磨漿3 min，磨漿后用120目的濾布將豆渣充分過濾去除，將制得的生豆漿放在水浴鍋中進行加熱，待豆漿溫度達到90℃時，計時10 min，然后將豆漿移至電熱爐保持沸騰5min。用攪拌器在240r/min條件下攪拌豆漿，使豆漿溫度降為86℃時迅速加入凝固劑 CaSO4，（2.8 g，2%），攪拌均勻后在保溫套中保溫12 min，此時不宜移動，然后將豆腐均勻破碎，先用10kg的重物壓制15min，繼而用20kg重物壓制15min，得到豆腐樣品，將其放在4℃冰箱中保藏24 h。

1.4 豆漿產量的測定

測定豆漿中蛋白質為6 Brix時的體積，結果用mL表示。

1.5 豆腐產量的測定

將新鮮的豆腐在室溫下靜置5 min稱重，計算每130 g大豆所得新鮮豆腐的重量。

1.6 豆漿蛋白質回收率的測定[20]

采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中方法。

蛋白質回收率/%=豆漿中蛋白質含量/原料豆中蛋白質含量×100

1.7 胰蛋白酶抑制因子活性的測定[20-22]

參考燕方龍等發表的方法，略有改動，過程簡述如下：

1）酶濃度的調整，使胰蛋白酶溶液濃度的吸光度范圍在0.380～0.420之間。

2）樣品濃度的調整，使其1.0 mL樣品稀釋液的吸光度范圍在0.190～0.210之間。

3）測定樣品中胰蛋白酶抑制因子活性。

按公式計算樣品中胰蛋白酶抑制劑活性：U=TIU×50×D/m

式中：U為每克樣品中胰蛋白酶抑制劑活性，TIU/g，TIU為每毫升樣品中胰蛋白酶抑制劑活力；50為樣品萃取液體積，mL；D為樣品提取液的稀釋倍數；m為樣品的質量，g。

2 結果與分析

2.1 不同制漿工藝對豆漿中蛋白質回收率及豆腐產量的影響

采用干法生漿、干法熟漿、濕法生漿、濕法熟漿、發芽豆生漿、發芽豆熟漿加工工藝對克山1號、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10所制得的豆漿、豆腐產量以及豆漿中蛋白質回收率的測定結果見表1。

表1 不同大豆品種及制漿工藝對豆漿中蛋白質回收率及豆漿、豆腐產量的影響Table 1 Effects of different soybean varieties and pulping technology on protein recovery in soybean milk and soybean milk yield and tofu produce

由表1中數據可知，不同大豆品種采用的不同制漿工藝制備的豆漿、豆腐產量均具有顯著性差異（P＜0.05），在相同品種下，熟漿所制備的豆漿平均產量為175.92 mL；熟漿所制備豆腐的平均產量為378.67 g。生漿所制備豆漿的平均產量為169.33 mL；生漿所制備豆腐的平均產量為362.0 g。生漿制備的豆漿中水溶性蛋白平均含量為27.70 g/100 g；熟漿制備的豆漿中水溶性蛋白平均含量為28.02 g/100 g。采用浸泡豆所制得的豆漿中水溶性蛋白含量低于干豆所制得的豆漿中水溶性蛋白含量，大豆浸泡吸水后，使得豆漿產量降低，營養物質減少。然而豆子發芽后所制得的豆漿中蛋白含量明顯低于干豆所制得豆漿中蛋白含量。采用濕法工藝時豆腐產量最大為395.5 g；采用半干法工藝時豆腐平均產量為367.6 g；以發芽豆為原料所制備的豆腐平均產量最低為348.8 g。由此可得熟漿工藝制備的豆漿、豆腐的產量大于生漿工藝，這是由于熟漿工藝的溫度較高，蛋白質更易提取出來。綜上所述，依次采用濕法熟漿、濕法生漿、半干法熟漿、半干法生漿、發芽豆熟漿、發芽豆生漿所得豆制品水溶性蛋白回收率依次降低。

2.1.2 不同制漿工藝對豆漿、豆腐品質間相關性分析

干法生漿對大豆品質性狀間的相關性分析見表2～表 7。

由相關性分析表明，不同制漿工藝豆漿、豆腐產量以及水溶性蛋白含量，這3項指標兩兩均呈現顯著正相關關系，采用干法生漿、濕法生漿、濕法熟漿、發芽熟漿時，蛋白質回收率與上述3個指標同樣呈現正相關關系，而采用干法熟漿時，水溶相蛋白與蛋白質回收率呈現負相關關系，采用發芽生漿工藝時，蛋白質回收率與上述3個指標呈現負相關關系。

表2 干法生漿對大豆品質性狀間的相關性分析Table 2 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with dry pulp

表3 干法熟漿對大豆品質性狀間的相關性分析Table 3 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with dry cooked pulp

表4 濕法生漿對大豆品質性狀間的相關性分析Table 4 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with wet pulp

表5 濕法熟漿對大豆品質性狀間的相關性分析Table 5 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with wet cooked pulp

表6 發芽生漿對大豆品質性狀間的相關性分析Table 6 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with germination pulp

表7 發芽熟漿對大豆品質性狀間的相關性分析Table 7 Analysis of correlation between the quality characters ofsoybean with germination cooked pulp

在相同制漿工藝時，不同品種所制得的豆漿、豆腐產量與豆漿中水溶性蛋白含量成正相關。這在一定程度上說明豆漿中水溶性蛋白含量越高，豆漿、豆腐產量越高，這與黃明偉等試驗結果一致。綜上所述，依次采用干法熟漿、干法生漿、濕法熟漿、濕法生漿、發芽豆熟漿、發芽豆生漿所得豆制品水溶性蛋白含量依次降低。

2.2 不同制漿工藝對胰蛋白酶抑制因子活性的影響

采用干法生漿、干法熟漿、濕法生漿、濕法熟漿、發芽豆生漿、發芽豆熟漿加工工藝對克山1號、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10所制得的豆漿、豆渣、豆腐、黃漿水中胰蛋白酶抑制因子活性測定結果見表8。

表8 不同大豆品種及制漿工藝對豆漿、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性的影響Table 8 Effects of different soybean varieties and pulping process on trypsin inhibitor activity in soybean milk and tofuTIU/g

如表8中數據可知，不同品種不同加工工藝制得的豆漿、豆渣、黃漿水、豆腐中的胰蛋白酶抑制因子活性具有顯著性差異（P＜0.05）。大豆中胰蛋白酶抑制因子含量由于品種、產地、年份的不同而有所差異，本試驗中大豆經過制漿后，豆漿、豆渣、黃漿水、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性與原料豆相比顯著降低（P＜0.05），說明打磨加熱過程對胰蛋白酶抑制因子活性有很大影響。通過表中數據發現，浸泡和發芽豆能減低胰蛋白酶抑制因子活性，這與楊道強等試驗結果一致。在浸泡過程中，胰蛋白酶抑制因子活性降低是因為一部分水溶性的胰蛋白酶抑制因子溶于浸泡豆子的水中，另一方面由于大豆中一些水解酶的激活降解了部分胰蛋白酶抑制因子。經過發芽后大豆制作的豆漿、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性如表所示，以發芽后大豆為原料所制得的豆漿、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性顯著低于發芽前（P＜0.05），并且與浸泡后的豆子所制得的豆漿、豆腐中相比，胰蛋白酶抑制因子活性最低。這是由于發芽過程中各種酶被激活，使胰蛋白酶抑制因子逐步水解，用于胚芽生長而降低了活性。通過生漿與熟漿數據對比發現，熟漿所制得豆漿、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性明顯低于生漿，說明加熱有效地使胰蛋白酶抑制因子失活。由此可見，同時采用熟漿工藝與發芽豆相結合使胰蛋白酶抑制因子活性降低的效果最好。

3 討論

豆制品中含有蛋白酶抑制因子、凝集素、皂苷等抗營養因子，豆制品產量是一個重要指標，本研究選取胰蛋白酶抑制因子進行分析測定，采用紫外分光光度法測其活性。本試驗采取6種不同的制漿工藝，旨在分析不同的制漿工藝對胰蛋白酶抑制因子活性的影響，在保證豆制品產量最大的前提下，找出抑制因子活性最低的工藝，為豆制品加工適用性及工業生產提供理論依據。

試驗結果表明，不同品種及制漿工藝對豆漿、豆腐產量以及豆漿中水溶性蛋白含量有很大影響，采用濕法熟漿所制得的豆腐產量最大，平均值約為415.4 g，這與郭順堂試驗結果一致[23]。采用發芽豆生漿所制得的豆腐產量最小，平均值約為330.7 g。通過試驗數據可知，不同制漿工藝對不同品種的豆漿、豆渣、豆腐、黃漿水中胰蛋白酶抑制因子活性具有顯著性差異，這說明不同工藝、不同品種對胰蛋白酶抑制因子活性產生的影響很大。通過比較可以發現徐豆14與濉科12有利于工業生產胰蛋白酶含量較低的豆制品。在以徐豆14為原料時，干法熟漿中活性降低的程度低于干法生漿，降幅達到2%，說明熱處理可以有效降低豆漿、豆腐中的胰蛋白酶抑制因子的活性；在濕法熟漿與干法熟漿的比較中發現，濕法熟漿的豆漿、豆腐中抑制因子活性低于干法熟漿，降幅達到1.5%，這有可能是在浸泡過程中一部分胰蛋白酶抑制因子隨水分流失，降低了豆子中胰蛋白酶抑制因子的含量。這與吳非、李紅梅等研究結果一致[24]。在以濉科12為原料時發現發芽豆生漿所制得的豆漿、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性低于濕法生漿，說明有可能在種子萌發過程中，大豆胰蛋白酶抗營養因子被種子自身的酶系所分解[25]。

綜上所述，可以發現與干法制漿相比，濕法制漿和發芽豆處理均降低了胰蛋白酶抑制因子活性，其中發芽處理的效果最佳，并且采用同種方法不同品種間抗營養因子活性降低程度和幅度也不同。這與朱曉倩等[26]的結果研究一致。Osman研究發現，扁豆在發芽1天后，胰蛋白酶抑制劑含量即顯著降低（P＜0.05），且隨著發芽時間的延長，降低更為顯著，5天后其含量下降19.4%[27]。所以在采用相同制漿工藝時，徐豆14和濉科12為原料有利于工業生產較低大豆胰蛋白酶抑制因子含量的豆制品；在同一品種的條件下，發芽豆濕法熟漿制漿工藝所制得的豆制品胰蛋白酶抑制因子含量較低。綜合蛋白含量考慮，以濉科12為原料采用濕法熟漿制漿工藝能生產出高蛋白含量、低抑制因子活性的豆制品。