NaCl脅迫聯合Ca2+調控糙米發芽富集GABA的工藝優化

（吉林工商學院糧食學院，吉林長春130507）

糙米營養豐富，但由于保留了富含纖維質的米糠層，使其口感較差、不易消化，嚴重限制了其銷量[1]。研究發現，糙米經發芽后，食用品質改善、化學成分改變[2]、營養價值會明顯提高[3]，同時會富集一些功能性營養成分[4-5]，尤其是對人體具有生理調節功能的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），其含量是糙米的3 倍，大米的 10 倍[2，6]。

GABA是一種天然存在的四碳非蛋白質氨基酸，因具有改善腦機能、降血壓、抗衰老、促進長期記憶以及預防消化道癌癥等多種保健功能，近年來受到國內外的廣泛關注[7-8]。研究表明，植物中的GABA合成轉化途徑有兩條，谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）分別為這兩條途徑合成GABA的關鍵酶[9]，其中GAD起主導作用。當植物受到冷激、熱激、干旱、低氧脅迫、酸脅迫及鹽脅迫等逆境脅迫時，會強烈刺激兩種酶的活性，從而使GABA大量富集[10]，其中鹽脅迫法簡單易行，且安全環保[11]。GAD是一種Ca2+/鈣調節依賴型酶，具有一個鈣調蛋白結合區[12]。已有學者研究發現，在植物籽粒發芽期間，施用Ca2+有助于GABA富集[13-14]。目前，鹽脅迫[1]、低氧脅迫[15]、低溫脅迫[16-17]對發芽糙米富集GABA的影響已有研究，而對NaCl脅迫聯合Ca2+處理下，優化培養條件富集糙米GABA的研究還鮮有報道。

本文采用NaCl脅迫聯合Ca2+處理的方式培養糙米發芽，通過Box-Behnken響應面分析法優化了發芽糙米富集GABA的工藝條件，研究了NaCl濃度、Ca2+濃度、發芽溫度及發芽時間4個因素對GABA富集的影響，以期為糙米的開發利用及富含GABA健康食品的制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米：品種為龍粳31，產自黑龍江??；GABA標準品（純度＞99%）：Sigma試劑公司；其他試驗試劑均為分析純；試驗用水均為三級水。

1.2 儀器與設備

LHS-250HC-I型恒溫恒濕箱、DHG-9245A型鼓風干燥箱、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；JXFM110型錘式旋風磨：杭州大吉光電儀器有限公司；N2型分光光度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；LE204E型分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-10C型高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 糙米發芽處理

選取籽粒飽滿、成熟度高、無裂痕的糙米粒，每份10.0 g，蒸餾水沖洗3遍，浸泡于1%的次氯酸鈉溶液中滅菌10 min，蒸餾水沖洗數次后濾干。加入10倍體積的一定濃度的NaCl和CaCl2混合溶液，30℃下浸泡12 h，取出后均勻的攤于鋪有濕潤紗布的培養皿中，蓋上紗布，其中紗布已用NaCl和CaCl2混合溶液潤濕，轉入恒溫恒濕培養箱中培養，培養過程中，每隔4小時均勻噴灑2 mL NaCl和CaCl2混合溶液。培養結束后，用蒸餾水清洗3遍，放入45℃鼓風干燥箱中烘干，粉碎后即為發芽糙米粉，過80目篩，于4℃保存，備用。

1.3.2 發芽糙米中GABA含量的測定

采用Berthelot法測定發芽糙米中的GABA。準確稱取2.0 g發芽糙米粉，蒸餾水定容至10 mL，超聲提取2小時后，3 000 r/min離心15 min，上清液中吸取400μL置于微量離心管中，加入600 μL pH=9.0硼酸緩沖溶液，混勻后分別加入質量分數為6%的重蒸苯酚溶液2 mL和質量分數為7.5%的次氯酸鈉溶液1 mL，振蕩混勻。沸水浴中煮沸10 min，迅速取出，置于冰浴中冷卻20 min，待溶液出現藍綠色后，加入體積分數為60%的甲醇溶液，630 nm處測定溶液吸光度值[18]。

1.3.3 單因素試驗

以NaCl溶液濃度、Ca2+溶液濃度、發芽溫度和發芽時間為試驗考察因素，以GABA為考察指標，確定各因素對GABA富集量的影響。

表1 糙米發芽試驗方案Table 1 Design of experiment of germinated brown rice

1.3.4 Box-Behnken響應面優化設計

結合單因素試驗結果，根據Box-Behnken試驗原理進行四因素三水平的試驗設計。采用Design-Expert 10.0進行試驗設計，以GABA含量為指標，對響應面試驗所得數據進行回歸分析，擬合優化出最佳富集GABA的工藝條件。試驗自變量因素編碼及水平見表2。

表2 響應面試驗因素水平Table 2 Factors and levels used in response surface experiments

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.2.1 NaCl溶液濃度對發芽糙米中GABA含量的影響

NaCl溶液濃度對發芽糙米中GABA含量的影響見圖1。

圖1NaCl溶液濃度對發芽糙米中GABA含量的影響Fig.1 Effect of sodium chloride concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖1所示，不同濃度的NaCl溶液對發芽糙米中GABA含量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。NaCl溶液濃度低于10 mmol/L時，GABA含量隨著NaCl溶液濃度的增加而增大。這是由于NaCl溶液在一定濃度范圍內會造成植物處于鹽脅迫逆境，從而促進GABA生成[19]。當NaCl溶液濃度達到10 mmol/L時，發芽糙米中GABA含量達到最大值，為101.82 mg/100 g，為未添加NaCl組（84.04 mg/100 g）的 1.21倍，此后，隨著 NaCl溶液濃度增大，GABA含量呈減小趨勢。

2.2.2 Ca2+溶液濃度對發芽糙米中GABA含量的影響

Ca2+溶液濃度對發芽糙米中GABA含量的影響見圖2。

圖2 Ca2+溶液濃度對發芽糙米中GABA含量的影響Fig.2 Effect of Ca2+concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖2所示，不同濃度的Ca2+溶液對發芽糙米中GABA含量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。Ca2+濃度在0～40 mmol/L時，發芽糙米GABA含量隨著Ca2+濃度的升高呈現先增加后降低的趨勢。這是由于添加Ca2+可提高GAD的活力[20]。當Ca2+溶液在20mmol/L時，GABA含量最高，為106.25 mg/100 g，為未添加Ca2+組（77.37 mg/100 g）的1.37倍。這表明在糙米發芽過程中，添加適當濃度的Ca2+溶液有助于富集GABA。

2.2.3 發芽溫度對發芽糙米中GABA含量的影響

發芽溫度對發芽糙米中GABA含量的影響見圖3。

圖3 發芽溫度對發芽糙米中GABA含量的影響Fig.3 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

如圖3所示，發芽溫度對糙米發芽富集GABA具有顯著性差異（P＜0.05）。發芽糙米的GABA主要是由發芽期間，糙米的胚芽所產生的[21]。當浸泡溫度較低時，不利于糙米發芽。隨著溫度的升高，糙米發芽速度變快，同時GAD的活性也隨著溫度的提高而升高。當發芽溫度在30℃時，GABA含量最高，為104.46 mg/100 g。隨著溫度的上升，GAD的活性受到抑制，導致GABA含量降低。因此，糙米發芽最適溫度為30℃。

2.2.4 發芽時間對發芽糙米中GABA含量的影響

發芽時間對發芽糙米中GABA含量的影響見圖4。

圖4 發芽時間對發芽糙米中GABA含量的影響Fig.4 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

如圖4所示，在1 d～2.5 d之間，隨著發芽時間的增加，GABA含量明顯增加，表明發芽時間對GABA含量具有顯著性差異（P＜0.05）。當發芽2.5 d時，GABA含量為115.39 mg/100 g。發芽時間超過2.5 d時，隨著發芽時間的延長，GABA富集速度明顯變慢，當發芽時間為3 d時，GABA含量為115.80 mg/100 g，與2.5 d沒有顯著性差異（P＞0.05），并且發芽時間過長，GABA會在轉氨酶的作用下，轉換成琥珀酸半醛，從而使GABA含量下降[22]。同時，發芽時間過長，會導致微生物生長，糙米發生霉變，品質下降。綜合考慮，發芽時間為2.5 d較為適宜。

2.2 響應面分析法優化糙米發芽工藝條件

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果分析

根據單因素試驗結果，應用Design-Expert軟件，以 NaCl溶液濃度（X1）、Ca2+溶液濃度（X2）、發芽溫度（X3）和發芽時間（X4）作為自變量，以GABA含量為響應值（Y），進行四因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗設計及試驗結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Experiments design and results of Box-Behnken

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗結果

對表3試驗結果采用Design-Expert軟件進行二次回歸響應面分析，建立了GABA（Y）二次響應面回歸模型，擬合的二次多項式方程為：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4-0.30X2X3+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56X22-20.36X32-15.07X42。

對該模型進行顯著性檢驗，結果見表4。

表4 發芽糙米GABA富集條件優化回歸模型顯著性檢驗Table 4 Significance test for the regression equation of optimal GABA accumulation conditions in germinated brown rice

該模型的相關系數R2=0.992 6，修正相關系數R2Adj=0.985 1，表明所建立的模型能解釋98.51%響應值的變化，可以用此模型對糙米發芽富集GABA試驗進行分析和預測。X1、X2、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32及 X42均對 GABA 含量具有極顯著影響（P＜0.01），X3和 X4對 GABA 含量具有顯著影響（P＜0.05）。X2X3對GABA含量影響不顯著（P＞0.05）。四因素對GABA 含量的影響順序為 X1＞X2＞X3＞X4。剔除不顯著項，擬合方程修訂為：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56 X22-20.36X32-15.07X42。

圖5為GABA含量的實測值與模型預測值之間的相關性分析，相關系數R2=0.996 3，表明兩者之間的相關性極好。綜上所述，所建立模型能很好的對GABA含量進行預測。

圖5 發芽糙米GABA含量實測值與預測值之間的相關性Fig.5 Correlation between predicted and observed values of GABA content in germinated brown rice

2.2.3 響應面分析

圖6 NaCl溶液濃度（X1）和 Ca2+溶液濃度（X2）響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and Ca2+concentration（X2）

圖7 NaCl溶液濃度（X1）和發芽溫度（X3）響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination temperature（X3）

圖8 NaCl溶液濃度（X1）和發芽時間（X4）響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination time（X4）

圖9 Ca2+溶液濃度（X2）和發芽溫度（X3）響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination temperature（X3）

圖10 Ca2+溶液濃度（X2）和發芽時間（X4）響應面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination time（X4）

圖6～圖11為根據線性回歸模型繪制的響應面及其等高線圖。根據此結果可以直觀分析因素間的交互作用對GABA含量的影響。響應面越陡峭，表明該試驗條件的改變對GABA含量影響越大[23]。從響應面圖可以看出，4個因素所形成的坡度都比較陡峭，尤其是X1和X2兩個因素更為陡峭，表明NaCl濃度和Ca2+濃度對GABA含量的影響較其余兩個因素要大。4個因素的變化趨勢均為先增大后降低，6個響應面均存在一個極大值點。等高線的性狀反應了因素間的交互作用的強弱，等高線呈橢圓形，表明兩個因素的交互作用顯著，呈圓形，則表明兩個因素的交互作用不顯著[24]。除圖9外，5個等高線圖均呈橢圓形，表明除Ca2+濃度和發芽溫度交互作用不顯著外，其余各兩因素間交互作用顯著。這一結果與顯著性分析結論相符。

圖11 發芽溫度（X3）和發芽時間（X4）響應面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour polt showing the effects of germination temperature（X3）and germination time（X4）

2.2.4 最優條件的確定及驗證

根據響應面優化分析，得到糙米發芽富集GABA的最佳工藝條件為NaCl溶液濃度為7.390 mmol/L，Ca2+溶液濃度為14.940 mmol/L，發芽溫度為28.829℃，發芽時間為2.298 d，預測發芽糙米GABA含量為145.29 mg/100 g。根據實際操作條件，將富集工藝調整為NaCl溶液濃度為7.50 mmol/L，Ca2+溶液濃度為15.0 mmol/L，發芽溫度為29℃，發芽時間為2.3 d。在此條件下進行糙米發芽富集GABA，作6次平行試驗，得GABA平均含量為144.98 mg/100 g。預測值與實測值相對誤差較小，說明所建立的模型具有較好的準確性及可靠性。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，以GABA含量為指標，采用Design-Expert軟件應用Box-Behnken響應面法進行四因素三水平優化試驗。方差分析結果表明NaCl濃度和Ca2+濃度對GABA含量具有極顯著性影響；NaCl濃度和Ca2+濃度、NaCl濃度和發芽溫度、NaCl濃度和發芽溫度、Ca2+濃度和發芽時間、發芽溫度和發芽時間的交互作用對GABA含量具有極顯著性影響；發芽溫度和發芽時間對GABA含量具有顯著性影響；Ca2+濃度和發芽溫度的交互作用對GABA含量無顯著性影響。由回歸方程得出，當NaCl濃度為7.390 mmol/L，Ca2+溶液濃度為14.940 mmol/L，發芽溫度為28.829℃，發芽時間為2.298 d時，發芽糙米GABA含量最大，預測值為145.29 mg/100 g?？紤]到實際操作的可行性，最后優化的富集條件為NaCl濃度為7.50 mmol/L，Ca2+濃度為15.0 mmol/L，發芽溫度為29℃，發芽時間為2.3 d。通過驗證試驗，實測值與預測值基本相符，說明所建立的回歸模型可較為準確的預測發芽糙米GABA含量，通過優化，可有效提高GABA含量，具有一定的實際指導意義。