響應面優化黃芪多糖的提取工藝

梁子敬，張景艷，馮海鵬，張凱，王磊，王旭榮，張康，李建喜

（中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，甘肅蘭州730050）

黃芪（Radix Astragali），又名綿芪，為豆科黃芪屬 多年生草本植物，分為膜莢黃芪和內蒙古黃芪兩種，主要產于內蒙古、甘肅、黑龍江和山西等地。其用于藥材迄今已有兩千多年的歷史，同時也是老百姓常食用的純天然品。通過研究人員近年來對黃芪的化學成分、藥理活性的研究，發現黃芪中含有多糖、蛋白質、氨基酸和黃酮等多種成分，其中多糖成分是主要的生物活性成分之一[1]。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides）主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，其具有免疫調節[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、抗炎[6-7]和保肝[8]等活性，特別以免疫調節功能最為突出[9]。

目前關于黃芪多糖的提取工藝，主要以熱水浸提法和纖維素酶解法等傳統溶劑法和酶解法為主，但其耗時、易使成分失活的弊端一直存在。近些年逐步興起的超聲波輔助提取法[10]、微波輔助提取法[11]等新技術解決了耗時和維持生物活性的問題，并且由于成本低，易操作的特點使其較傳統提取工藝優勢更為明顯。因此利用單因素和響應面法對黃芪多糖的提取工藝進行優化，旨在為黃芪多糖能更合理地開發和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膜莢黃芪根：蘭州市黃河中藥材市場；無水乙醇及其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機：溫嶺市大機械有限公司；標準60目篩：浙江上虞市金鼎標準篩具廠；Allegra X-15R臺式冷凍離心機：貝克曼庫爾特有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；KQ-600DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LGJ-10F型真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；BS 224 S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取工藝路線

膜莢黃芪→粉碎機粉碎→經60目篩子篩→稱重10 g→按相應液料比加純水→按相應提取功率和提取時間進行超聲→經紗布濾過后濃縮→3倍體積無水乙醇過夜沉淀→離心后，沉淀經無水乙醇清洗后再用純水清洗，凍干→稱重。

1.3.2 計算公式

1.3.3 單因素試驗

在提取時間分別為 20、40、60、80、100 min，提取溫度分別為 40、50、60、70、80 ℃，功率分別為 120、240、360、480、600W，液料比分別為 5∶1、10∶1、15∶1、20 ∶1、25∶1（mL/g）的條件下，按照1.3.1的方法和 1.3.2的得率計算方法，進行提取時間、提取溫度、提取功率、液料比4個因素對黃芪多糖得率的影響試驗。

1.3.4 響應面優化試驗設計

結合單因素試驗結果，選取提取時間、功率、液料比3個影響因素，再根據三因素三水平的響應面法，分別用 X1、X2、X3代表 3 個因素，以-1、0、1 代表變量的水平，對自變量進行編碼（表1）。其中Xi變量編碼值。采用多元回歸設計方法，以多糖得率（Y，%）作為響應值，通過Box-Behnken響應面分析確定最佳提取條件。

表1 試驗編碼和試驗參數對照關系Table 1 The comparison relationship between encode and actual concentration of factor

2 結果與分析

2.1 最佳單因素條件

2.1.1 提取時間單因素試驗

在提取溫度為 60℃、液料比為 15∶1（mL/g）、功率為360 W條件下，選取提取時間分別為20、40、60、80、100 min進行提取時間因素對黃芪多糖得率的影響試驗，見圖1。

圖1 提取時間對多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

由圖1可知，多糖得率在提取時間從20 min至80 min之間呈遞增的趨勢，并且提取時間在80 min時達到較大值，往后趨于平緩。表明提取時間在一定范圍內可以增加多糖得率，但時間過長會導致多糖結構的破壞。因此，結合多糖得率以及在節省時間的考慮下，選擇較優的提取時間為80 min。

2.1.2 提取溫度單因素試驗

在提取時間為 60 min、液料比為 15 ∶1（mL/g）、功率為360 W條件下，選取提取溫度分別為40、50、60、70、80℃進行提取溫度因素對黃芪多糖得率的影響試驗，見圖2。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，多糖得率在提取溫度從40℃至80℃之間呈遞增的趨勢，并且提取溫度在80℃時達到最大值。表明在一定范圍內，提取溫度越高，多糖得率越大。因此，選擇較優的提取溫度為80℃。

2.1.3 提取功率單因素試驗

在提取時間為60 min、提取溫度為60℃、液料比為15∶1（mL/g）條件下，選取功率分別為120、240、360、480、600 W進行功率因素對黃芪多糖得率的影響試驗，見圖3。

圖3 提取功率對多糖得率的影響Fig.3 Effect of power on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，多糖得率在提取功率從120 W至600 W之間呈依次遞增的趨勢，并且提取功率在600 W時達到最大值。多糖得率從480 W至600 W放緩，可能是由于功率過大而破壞了多糖結構。因此，結合多糖得率和實際操作選擇較優的提取功率為480 W。

2.1.4 液料比單因素試驗

在提取時間為60 min、提取溫度為60℃、功率為360 W 條件下，而液料比分別為 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）下進行液料比因素對黃芪多糖得率的影響試驗，見圖4。

由圖4可知，多糖得率在料液比從5∶1（mL/g）至20∶1（mL/g）之間呈依次遞增的趨勢，并且料液比在20∶1（mL/g）時達到最大值，而后多糖得率開始下降。因此，選擇較優的液料比為20∶1（mL/g）。

圖4 液料比對多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.2 響應面優化多糖提取工藝

2.2.1 Box-Benhnken設計試驗結果與分析

根據Box-Behnken原理設計試驗，結合單因素試驗結果確定因素的水平范圍，將多糖得率作為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

由表2可知，當提取時間為60 min，提取功率480 W，液料比20∶1（mL/g）時，黃芪多糖的得率最高為6.215%。采用Design Expert 8.0軟件對數據進行二次多項回歸擬合，模型擬合結果為Y=5.79+0.38X1+0.46X2+0.5X3+0.22X1X2+0.12X1X3+0.42X2X3-0.85X12-1.26X22-0.37X32，R2=0.965 2。方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance results

由表3可知，該模型回歸極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），且 R2=0.965 2，R2Adj=0.920 5，說明該模型與試驗擬合較好。另外，模型中的一次項X1、X2、X3，二次項 X12、X22、X32和交互項 X2X3的 P 值均＜0.05，表明該試驗的各因素以及因素間的交互作用對黃芪多糖的得率有顯著影響。由F值可知，各因素對黃芪多糖提取率變化的貢獻大小為：提取功率＞液料比＞提取時間。

2.2.2 響應面及等高線結果

通過回歸模型，可以分別得到任意兩因素以及其交叉作用對黃芪多糖得率的等高線圖和響應面圖。時間和液料比對多糖得率影響見圖5，時間和功率對多糖得率的影響見圖6，液料比和功率對多糖得率的影響見圖7。

由圖5可知，當提取時間一定時，隨著液料比的增大，多糖的提取量呈現先遞增后遞減的趨勢，反之，當液料比一定時，隨著提取時間的增加，多糖的提取率呈現先遞增后趨于平緩。表明液料比對多糖提取率影響較大，且兩因素交互作用較顯著。

圖5 提取時間和液料比對多糖得率的交互作用的等高線和響應面Fig.5 Ultrasonic treatment time and liquid-solid ratio on the interaction polysaccharides yield of a response surface plot and contour line

圖6 提取時間和提取功率對多糖得率的交互作用的等高線和響應面Fig.6 Ultrasonic treatment time and ultrasonic power on the interaction polysaccharides yield of a response surface plot and contour line

由圖6可知，當提取時間一定時，隨著提取功率的增大，多糖得率呈現出先遞增后平緩的趨勢，反之亦然，當提取功率一定時，隨著提取時間的增加，多糖的提取率也呈現出先遞增后趨于平緩。

圖7 液料比和提取功率對多糖得率的交互作用的等高線和響應面Fig.7 Ultrasonic liquid-solid ratio and ultrasonic power on the interaction polysaccharides yield of a response surface plot and contour line

由圖7可知，當液料比一定時，隨著提取功率的增大，多糖的得率呈現出遞增的趨勢，而當提取功率一定時，隨著液料比的增加，多糖的得率呈現出先遞增后趨于平緩，表明液料比和功率對多糖得率影響較大，且兩因素交互作用顯著。

2.2.3 驗證試驗

通過Design Expert 8.0軟件分析的得到黃芪多糖得率的最優工藝條件：提取時間86.81 min，液料比21.84∶1（mL/g），功率 591.94 W，得率為 6.18%。參考最優條件，結合實際后確定最終優化方案為：提取時間 87 min，液料比 22∶1（mL/g），提取功率 600 W。根據最終優化方案進行驗證試驗，得到黃芪多糖的得率為6.07%，與模型的理論值相差1.78%，由此可見，應用該模型改進超聲波提取黃芪多糖是可行的。

3 結論

本文采用Design Expert 8.0軟件，通過響應面分析得到多糖得率和提取時間、提取功率和料液比因素的模型方程，各因素對黃芪多糖得率變化的貢獻大小依次為提取功率、液料比和提取時間，且液料比與功率交互作用最為顯著。最佳提取工藝參數為提取時間87 min，液料比 22 ∶1（mL/g），提取功率 600 W，得率為6.07%。因此，在保證得率的前提下，利用超聲波提取法使得黃芪多糖的提取更為高效。