發酵型藤茶沖泡工藝及其抗氧化性能研究

秦振華，蘭奎，劉梁，程群鵬，李建芬，*

（1.武漢輕工大學化學與環境工程學院，湖北武漢430023；2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

藤茶學名顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），屬于葡萄科蛇葡萄屬，是一種野生藤本植物，主要分布于我國長江流域以南，如云南東南部、福建、兩廣、湖南等地，集中或散生于海拔400 m～1 300 m的山坡混交林中。自古以來，藤茶就有良好的保健作用，在我國南方民間應用歷史悠久，應用范圍廣泛，對緩解咽喉腫痛、保肝護肝、醒腦安神等方面具有良好的應用效果[1-2]，民間多采其幼嫩莖葉加工成茶類產品，其味微甘、苦、性涼。藤茶富含黃酮類成分，據報道藤茶中總黃酮含量可高達41.2%左右，其中二氫楊梅素含量可達30%左右[3-5]。現代藥理活性研究表明，二氫楊梅素具有極好的抗氧化活性，能夠有效清除自由基[6]，在維持機體正常代謝和生理保健中起到了非常積極的作用[7-9]。

隨著醫療模式逐漸由單純的治療型向預防、保健、康復相結合的模式轉變，人們也越來越重視藥食兩用植物資源的保健作用。藤茶作為一種富含天然抗氧化物的飲品，成為了目前的研究熱點[2，10]。但是藤茶的研究多集中于其加工工藝[11-12]、活性成分分析[13-14]、化學成分的含量測定[15-16]、藤茶黃酮提取工藝等方面[17-18]，對藤茶的沖泡工藝的研究鮮有報道。然而，藤茶作為一種健康飲品，與其他名茶類似，沖泡工藝也必將是影響其抗氧化活性的重要因素[19-21]。為了讓藤茶的抗氧化活性在日常沖泡中得到充分有效的利用，對日常沖泡藤茶的主要因素進行系統考察，以期為科學飲用藤茶提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵型藤茶：利川市多仁多實業有限公司；焦性沒食子酸、鹽酸、三（羥甲基）氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、七水硫酸亞鐵、無水乙醇、水楊酸、30%過氧化氫：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

Nicolet IS10紅外光譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；Lambda25紫外分光光度計：美國珀金埃爾默儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；KQ5200DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州智博瑞儀器制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

以發酵型藤茶為樣品，在不同沖泡溫度、次數、水質、時間條件下進行試驗，研究不同條件對藤茶茶湯抗氧化活性的影響。同時比較藤茶和綠茶的抗氧化能力，試驗中采用水楊酸法和鄰苯三酚法分別以羥基自由基清除率和超氧自由基清除率評價藤茶的抗氧化活性[14，22]。

1.3.1 水質對藤茶抗氧化活性的影響

稱取3份1.0 g藤茶，分別用60 mL 80℃去離子水、自來水和泉水在恒溫振蕩器中沖泡20 min，振蕩頻率為150 r/min。過濾離心后，測定不同沖泡茶湯對自由基的清除率。

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1.3.2 茶湯用量對自由基清除率的影響

稱取1.0 g藤茶，加入60 mL 80℃的去離子水在恒溫振蕩器中沖泡20 min，過濾后的濾渣繼續同樣操作進行第2次沖泡，濾液進行離心，測定加入不同用量1次和2次茶湯時的自由基清除率。

1.3.3 沖泡次數對藤茶抗氧化活性的影響

稱取1.0 g藤茶加入60 mL 80℃的去離子水，在恒溫振蕩器中沖泡20 min，過濾后的濾渣繼續同樣操作的第2次沖泡、第3次沖泡直至第5次沖泡，濾液進行離心后測定不同沖泡次數的茶湯的自由基清除率。

1.3.4 沖泡時間對藤茶抗氧化活性的影響

稱取1.0 g藤茶加入60 mL 80℃去離子水，在恒溫振蕩器中分別沖泡 10、20、30、40、50 min，過濾離心后測定茶湯的自由基清除能力。

1.3.5 沖泡溫度對藤茶抗氧化活性的影響

稱取1.0g藤茶加入60mL不同溫度（50、60、70、80、90、100℃）的去離子水，在恒溫振蕩器中沖泡20 min后，過濾離心，測定茶湯的自由基清除能力。

分別稱取1.0 g藤茶和1.0 g綠茶，分別加入60 mL 80℃的去離子水在恒溫振蕩器中沖泡20 min，過濾離心后，測定茶湯的自由基清除率。并將不同品種的茶湯各自分成兩份，一份儲藏在冰箱中，另外一份在室溫環境下儲存，每隔1、3、5、7天測定放置在不同環境中的茶湯的自由基清除能力。

2 結果與分析

2.1 藤茶的抗氧化研究

藤茶茶湯干燥物的紅外光譜及藤茶的羥基自由基清除活性見圖1。

其中圖1（a）是藤茶茶湯經過70℃旋轉蒸發所得干燥物的紅外吸收光譜，其中波數3 125 cm-1的吸收峰由羥基振動吸收引起，波數1 633 cm-1的吸收峰由羰基振動吸收引起，波數1 549 cm-1和1 456 cm-1的吸收峰由芳環振動吸收引起，這與文獻的二氫楊梅素的紅外光譜結果一致[23]，說明藤茶茶湯的干燥物中含有豐富的二氫楊梅素，這為藤茶的抗氧化活性提供了充足的物質基礎。試驗中采用水楊酸法研究了藤茶茶湯對羥基自由基的清除能力，如圖1（b）所示，空白對照試驗中水楊酸與羥基自由基反應生成的2，3-二羥基苯甲酸在520 nm處有特殊吸收，而在反應體系中加入0.2 mL 1次茶湯后，520 nm處的吸光度明顯降低，說明藤茶茶湯對羥基自由基有優異的清除能力。故而本試驗選擇反應體系在520 nm處吸光度的變化來考察沖泡工藝對茶湯抗氧化能力的影響。

圖1 藤茶的紅外光譜及抗氧化實驗Fig.1 The IR spectroscopy and antioxidant research of vine tea

2.2 水質對羥基自由基清除率的影響

水質對羥基自由基清除率的影響如圖2所示。

圖2 水質對羥基自由基清除率的影響Fig.2 The effect of water quality on clearance rate of hydroxyl radical

結果表明自來水沖泡的抗氧化活性最低，主要是因為自來水中次氯酸的強氧化性氧化了藤茶中的有效成分，降低了藤茶的抗氧化活性，此外自來水中的雜質較多，采用自來水沖泡的茶湯色澤較深。如圖所示去離子水沖泡的藤茶的抗氧化活性最高，0.5 mL 1次茶湯對羥基自由基的清除率達到了81.9%，沖泡效果最好，礦泉水其次，但日常生活中很難得到去離子水，所以綜合考慮茶質和湯色，在日常沖泡藤茶時可選用礦泉水。

2.3 茶湯用量對羥基自由基清除率的影響

茶湯用量對羥基自由基清除率的影響見圖3。

圖3 茶湯用量對羥基自由基清除率的影響Fig.3 The effect of tea dosage on clearance rate of hydroxyl radical

在自由基清除率為20%～70%時，茶湯用量與清除率均呈良好的線性關系。但是當其清除率超過75%以后，茶湯的清除自由基能力上升開始變緩。圖3a中羥基自由基清除率（y%）與1次茶湯用量（mL）之間線性方程是：y＝247.5x-6.5，線性擬合系數為0.99。圖3b中自由基清除率線性方程是：y＝27.15x-6.13，線性擬合系數為0.99。一般可選用IC50值來表示不同抗氧化劑的抗氧化性強弱，IC50值表示半抑制濃度，采用該方法測定的1次茶湯和2次茶湯的IC50值分別為0.23 mL和2.07 mL。IC50值越低，抗氧化劑的自由基清除能力越強，可見1次茶湯溶出的抗氧化性物質明顯多于2次茶湯。

2.4 沖泡次數對羥基自由基清除率的影響

沖泡次數對羥基自由基清除率的影響見圖4。

分別取0.5mL茶湯考察其對羥基自由基的清除能力，其中沖泡1次的茶湯對羥基自由基的清除率達到了76.0%，而2、3、4、5次的茶湯清除效果明顯下降，但2次茶湯對羥基自由基的清除率依然有31.5%，3、4、5次茶湯的自由基清除率已經降到了10%以下，這與圖3的結果較為一致，表明發酵后的藤茶中抗氧化物質有較好的溶出能力，所以為了保證藤茶茶湯有較好的抗氧化能力，最佳沖泡次數為1次～2次。

圖4 沖泡次數對羥基自由基清除率的影響Fig.4 The effect of different brewing times on the clearance rate of hydroxyl radical

2.5 沖泡時間對羥基自由基清除率的影響

沖泡時間對羥基自由基清除率的影響如圖5所示。

圖5 沖泡時間對羥基自由基清除率的影響Fig.5 The effects of brewing time on the clearance rate of hydroxyl radical

藤茶的抗氧化活性隨沖泡時間的增加呈先增后減的趨勢，在20 min時達到最大值，這說明藤茶中的抗氧化活性物質的溶出隨時間的增加而增加，但在較高溫度下保持過長時間時二氫楊梅素會發生不可逆的氧化反應，即沖泡時間過長會導致部分有效物質被氧化，茶湯的抗氧化活性反而降低，所以最佳沖泡時間不宜超過20 min。

2.6 沖泡溫度對羥基自由基清除率的影響

沖泡溫度對羥基自由基清除率的影響如圖6所示。

在50℃至80℃的范圍內，羥基自由基的清除率隨溫度升高而增加，80℃后，藤茶嫩芽嫩葉的易熟化、結膜，阻止了部分抗氧化物質的溶出，而100℃時清除率再次升高，可能原因是藤茶中一些抗氧化物質在該溫度下溶出增加，尤其是一般認為藤茶中的主要成分二氫楊梅素易溶于熱水，所以可能是二氫楊梅素在100℃下的溶出速率大于被氧化速率，而且考慮此溫度下，文獻表明茶葉中的茶多酚、維生素C等一些有益成分會遭到破壞[24]，同時圖3和圖4的結果已經表明發酵型藤茶中活性物質具有很好的一次溶出率，因此，過高的沖泡溫度會影響后續的沖泡口感和風味。所以綜合考慮建議藤茶的沖泡溫度為80℃。

圖6 沖泡溫度對羥基自由基清除率的影響Fig.6 The effect of different brewing temperature on clearance rate of hydroxyl radical

2.7 藤茶最佳沖泡工藝的正交試驗

根據單因素試驗結果，選取沖泡溫度（70、80、90℃）、沖泡時間（10、20、30 min）、沖泡次數（1、2、3）3 個因素，以0.2 mL沖泡茶湯的羥基自由基清除率為試驗指標，設計三因素三水平正交試驗[24-25]。正交試驗的結果見表1。

表1 正交試驗結果Table 1 Results of orthogonal test

極差分析顯示，沖泡次數對發酵型藤茶茶湯的羥基自由基清除率有很大的影響，這說明藤茶經過發酵處理后，其中的活性成分有較好的溶出效果。從表1發現影響藤茶茶湯的抗氧化活性的主次關系為沖泡次數＞沖泡溫度＞沖泡時間，最佳沖泡工藝組合為A2B2C1，即沖泡溫度為80℃，沖泡時間20 min，沖泡1次，驗證試驗顯示此條件下0.2 mL沖泡茶湯的羥基自由基清除率可以達到48.2%，說明此時沖泡得到的藤茶茶湯具有最佳的抗氧化活性。

2.8 藤茶和綠茶放置時間對羥基自由基清除率的影響

藤茶和綠茶放置時間對羥基自由基清除率的影響見圖7。

圖7 藤茶和綠茶放置天數對羥基自由基清除率的影響Fig.7 The effect of days of vine tea and green tea on clearance rate of hydroxyl radical

結果表明藤茶的抗氧化性明顯強于綠茶，放在冰箱中的藤茶和綠茶茶湯的抗氧化活性隨著放置天數的增加而基本不變。然而，放在室溫下的綠茶茶湯的抗氧化活性明顯下降，而藤茶茶湯的抗氧化活性變化較小，這與民間形容藤茶茶湯經久不餿的說法相契合，說明藤茶的抗氧化能力在室溫下具有很高的穩定性。

2.9 藤茶茶湯對超氧陰離子自由基的清除作用

藤茶茶湯對超氧陰離子自由基的清除作用見圖8，鄰苯三酚自氧化和加入一次茶湯后反應體系的吸光度隨時間變化關系見圖9。

結果表明在200 nm～800 nm的波長范圍內空白鄰苯三酚沒有出現吸收峰，鄰苯三酚自氧化體系的吸收峰在320 nm處和420 nm處，加入1次茶湯抑制后的反應體系可能因為黃酮類物質的存在，使得反應體系的吸收峰在320 nm處與自氧化的重疊且高于后者，但是在420 nm處自氧化出現的吸收峰被抑制，說明藤茶茶湯對超氧陰離子自由基也有良好的的清除作用。因為320 nm處的吸收峰要強于420 nm處，所以本試驗選用320 nm作為吸光度的作為測量波長，茶湯在該波長下的吸收可采用空白對照進行消除。由圖分析可知，鄰苯三酚自氧化速率（min-1）為0.060，而加入茶湯后鄰苯三酚自氧化速率有所下降，此時的速率（min-1）為0.039，從而可得出茶湯對鄰苯三酚自氧化的抑制率為35%，說明藤茶茶湯對超氧陰離子自由基也有較好清除能力。

圖8 鄰苯三酚紫外可見光光譜圖Fig.8 UV-Vis spectrum of pyrogallol

圖9 反應體系的吸光度隨時間變化Fig.9 The absorbance of the reaction system varies with time

3 結論

以羥基自由基的清除率為評價標準，模擬日常生活中藤茶的沖泡工藝，采用水楊酸法對水質、溫度、沖泡次數、時間等條件進行了研究，同時還采用鄰苯三酚法作為輔助手段，以超氧陰離子自由基的清除率為標準，對部分沖泡工藝進行了考察，發現日常生活中藤茶的最佳沖泡工藝為用80℃去離子水單次沖泡20 min，此時0.2 mL茶湯對羥基自由基的清除率可達到48.2%，當茶湯的用量達到0.5 mL時，其對羥自由基的清除率甚至可以達到81.9%，這體現了藤茶優異的抗氧化活性。正交試驗表明影響藤茶茶湯的抗氧化活性的主次關系為沖泡次數＞沖泡溫度＞沖泡時間。同時通過比較藤茶和綠茶這兩種茶葉，發現藤茶對羥基自由基的清除率明顯高于綠茶，且在放置數天的情況下，藤茶對羥基自由基的清除率基本不變，而綠茶則顯著下降，這說明藤茶具有優異和穩定的抗氧化性能，是一種理想的日常飲品。